miRNA与胰腺癌的早期诊断

刘明浩 杜奕奇 李兆申

miRNA与胰腺癌的早期诊断

刘明浩 杜奕奇 李兆申

20世纪60年代，随着RNA的发现，人们认为RNA在基因的表达调控过程中起着至关重要的作用。近些年，人们发现了一些长度在18～24个核苷酸的小分子RNA(miRNA和siRNA)，通过对RNA转录后的调节参与许多生理过程的调控，如细胞生长和凋亡、血细胞分化、同源异形盒基因调节、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生、胚胎发育和脂肪代谢等，且其在物种的进化中相当保守，因此miRNA的研究受到了人们的广泛关注。

一、miRNA的特点

microRNA(简称miRNA)是1993年Lee[1]在线虫发育的研究中首次发现的一类非编码小分子RNA，长约18～24个核苷。miRNA只被内源性的基因转录产生Pri-RNA，然后被加工成熟。其过程包括：RNA转录酶Ⅱ(Pol Ⅱ)完成miRNA的转录[2]，形成长链的RNA前体，然后被RNA聚合酶ⅢDrosha[3]和Pasha/DGCR8[4]加工成为大约70～100个核苷酸发夹结构的pre-miRNA。Pre-miRNA通过依赖RanGTP/Exportin 5转运机制从细胞核转运到细胞质[5]，被RNA聚合酶ⅢDICER加工后形成两条RNA链，一条组装到含有argonaute的沉默复合体内(RISC)，形成成熟miRNA，而另一条链降解[6]。

miRNA与靶RNA以碱基对相互作用的方式调节基因的转录后表达，其作用机制仍然有争议，但是抑制翻译和降解mRNA这两种方式比较明确，其中对mRNA的降解与RNA干扰途径比较相似。在动物体内，miRNA常以不完全配对的方式作用于靶mRNA，这些作用位点多位于3端的非翻译区(3′-UTRs)。如果miRNA和靶mRNA3′-UTRs不完全互补配对，则通过翻译抑制靶mRNA的表达，如线虫中的let-7与靶mRNA3′-UTRs不完全配对结合后抑制基因的翻译。当miRNA与靶基因完全互补结合时，直接降解mRNA，如果蝇和HeLa细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA[7]。最近研究提出，另外一种去腺苷酸化机制也参与了miRNA的基因调控，这种调控与3′腺苷酸尾的清除有关，且该过程不可逆转[8]。已经公布的miRNA数据库记载了695种人类的miRNA[9]，估计人体内miRNA总数将会在1000到1万种之间。一种miRNA可以调控几种不同基因的表达，几种miRNA可以联合调控一种RNA的表达，这样形成了一个庞大的网络调节人体内各种生理活动，因此对miRNA的研究具有重要的意义。

二、miRNA的研究方法

研究miRNA可以通过组织特异性克隆、生物学信息法和RT-PCR法；进行miRNA靶基因筛选的方法有miRU法、Microlnspector法及miRNA-miRNA复合物分析法。目前日益发展的微阵列技术在筛选miRNA基因方面显示了极大的潜力。最近，Driskell等人[10]建立了表面增强拉曼光谱法(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)用于miRNA检测和分类。实时定量PCR是定量检测循环miRNA最常用的有效方法。

三、miRNA与肿瘤

1．miRNA作为抑癌基因：在正常基因调控过程中，如复制、转录、翻译中任何一个步骤出现问题，都可能使正常细胞发生癌变。最早Calin等[11]证实了miRNA与肿瘤相关。miR-15a和miR-16-1在将近65%的慢性淋巴性白血病的病例中表达完全缺失。而miR-15a和miR-16-1的缺失可导致bcl-2的过表达，使受损细胞不能发生凋亡，进而导致肿瘤的形成。在肺癌、结肠癌等的研究中发现，let-7负调控原癌基因Ras/let-60的表达[12-13]，但不影响ras的RNA水平，说明let-7是通过抑制mRNA的翻译发挥作用，但不影响其转录作用。最近研究发现，let-7的另一靶癌基因——HMGA2。HMGA2作为一种原癌基因在良性和恶性间充质肿瘤等多肿瘤的形成中发挥作用[14]，而let-7可以负调控其表达。另有研究显示，miR-21通过直接下调抑癌基因tropomyosin 1(TPM1)而发挥作用[15]。

2．miRNA作为癌基因：Burk等[16]发现，与肿瘤恶性程度及转移有关的ZEB1可以直接抑制miR-200家族成员miR-141和miR-200c的转录，这些miRNA又可以负调节转化生长因子β2和ZEB1。ZEB1与这些miRNA形成了一个负反馈环路来调节上皮细胞的分化和肿瘤细胞的侵袭。miR-17基因簇，包括miR17-5p、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b1、miR-20和miR-92，在淋巴瘤中表达上调，说明其发挥癌基因的作用。Volinia等[17]用芯片分析了6种实体瘤(肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、胰管癌)的miRNA表达谱，发现miR-21均显著过表达，提示其在肿瘤形成过程中起广泛的致癌作用。

3．miRNA与人类肿瘤：文献报道的其他与癌症相关的miRNA有let-7、miR-17-92簇、miR-196a与肺癌，miR-34a与前列腺癌，miR-18、miR-223、miR-224与肝细胞癌，miR-125b、miR-145、miR-21、miR-155与乳腺癌，miR-143、miR-145与结直肠癌等。

四、miRNA表达谱在胰腺癌发生过程中的作用

1．特异性胰腺癌miRNA：Roldo等[18]的研究结果显示，miR-103与miR-107的表达联合miR-155的表达缺失可以用来区分胰腺癌和正常组织；一组含有10个miRNAs亚型的组合可以用来区分胰腺内分泌肿瘤和胰腺腺泡细胞肿瘤。Bloomston等[19]的研究发现，miR-21、miR-221、miR-222、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-155在肿瘤样本中过表达，其中miR-221最为显著。Szafranska等[20]研究发现，miR-216和miR-217的表达联合miR-133a的表达缺失可以用来鉴定胰腺组织。应用定量RT-PCR技术检测，只有miR-217和miR-196a在正常胰腺、慢性胰腺炎和肿瘤组织间差别显著。Lee等[21]采用实时PCR定量分析胰腺癌标本、胰腺良性肿瘤、慢性胰腺炎、正常胰腺组织和9种胰腺癌细胞株的200种前体miRNA表达和分布情况，结果发现miRNA的表达谱有明显的不同，其中包括miR-155、miR-21、miR-221、miR-222等；原位PCR进一步显示前三位表达的miR-221、miR-376a、miR-301定位于肿瘤细胞，而不在基质或正常腺管。Zhang等[22]研究了96种miRNA亚型在胰腺癌组织及细胞系中的表达，结果发现8种miRNAs(miR-196a、miR-190、miR-186、miR-221、miR-222、miR-200b、miR-15b、andmiR-95)有显著地过表达。

2．非特异性胰腺癌miRNA：Dillhoff等[23]比较胰腺癌及癌旁组织、慢性胰腺炎、正常胰腺组织中miR-21的表达水平，证实miR-21在胰腺癌组织中的表达显著上调，癌旁组织没有miR-21的过表达，但miR-21在肺癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌甚至胰腺的神经内分泌肿瘤都有过表达。miR-375在小鼠的胰岛细胞中特异性地表达，其在肿瘤组织比正常组织表达水平稍高，但不能区分胰岛素瘤和胰腺的非功能性肿瘤[18]。

3．其他与胰腺癌相关的miRNA：miR-21和miR-196a-2与胰腺癌的预后有关。如没有淋巴结转移，弱表达miR-21患者平均生存期与强表达miRNA患者平均生存期有差异(27.7个月对15.2个月,P=0.037)[23]。高表达miR-196a-2与低表达miR-196a-2患者的生存期也有显著差异(平均生存期14.3个月、95%CI12.4～16.2对平均生存期26.5个月、95%CI23.4～29.6,P=0.009)[19]。

在胰腺癌基因方面，miR-155通过负调控TP53INP1而发挥癌基因的作用[24]，p53基因可以抑制miR-221的表达。此外，某些miRNA与胰腺癌的功能及转移有关，如miR-204的过表达与胰岛素的分泌有关； miR-21的过表达与高ki67的增殖指数和出现肝转移有关[18]。

至今研究证实的胰腺癌、胰腺良性肿瘤、慢性胰腺炎、正常胰腺组织间miRNA表达谱的差异只是具体的miRNA亚型不同，某种miRNA表达上调或下调也有些出入。这些结果说明了miRNA表达的改变与胰腺的内分泌功能、胰腺肿瘤的发生及恶变有一定联系，但如果想作为胰腺癌肿瘤标记物应用于临床，还需要进行进一步研究。

五、血清miRNA与胰腺癌的早期诊断

血清miRNA具有良好的抗RNase降解能力，在煮沸、高或低pH值、长时间储存、冻融循环等条件下保持稳定，以完整的形式存在。因此，采用常规RNA提取方法就可以获得满足实验要求的miRNA。应用半定量RT-PCR的方法可以在正常人的血清和血浆中检测到let-7a、miR-192、miR-21、miR-25、miR-451和miR-221，并且男性和女性血清miRNA谱没有差异，两份无关的样本的miRNA是接近的[25]。正常人血清和血细胞miRNA谱无差异，但肺癌患者的血清和血细胞miRNA谱有显著差异(血清和血细胞中共存57种，73种只存在于血清中)[26]。提示可通过比较患者血清和血细胞miRNA的谱的差异来提高诊断肿瘤的特异性和敏感性。miRNA分子同已知的循环核酸(DNA和RNA)一样,广泛存在于正常人和不同患者的血清和血浆中,并且随着生理状况、疾病的种类和病程的不同,miRNA分子在血清中存在的种类和数量将发生变化。

以往研究证实，肿瘤会使血清中miRNA谱发生变化。最初Lawrie等[27]发现，在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中有较高水平的miR-21，且与肿瘤复发及患者生存期有关。miR-141做为前列腺癌的标志物有高度的敏感性和良好的特异性。Mitchell等[28]将人前列腺癌细胞株移植到小鼠制作出异种移植模型，小鼠血清中miR-141也显著地过表达。Chen等[26]报道，肺癌、结直肠癌及糖尿病患者血清中均有特殊的miRNA表达谱。如在正常血清中检测不到的63种miRNAs在肺癌患者血清中可以检测到；在肿瘤形成中起重要作用的miR-25和miR-223在肺癌患者的血清中呈高表达；结直肠癌与肺癌患者血清中一些肿瘤相关miRNA谱是相同的，提示肿瘤患者血清中存在一些共同的肿瘤相关miRNA谱。肿瘤导致的血清miRNAs水平的变化，还不清楚是肿瘤细胞坏死或脱落进入周围循环后释放miRNAs，还是肿瘤细胞直接释放miRNAs进入周围循环。因此，还需更加努力深入地研究。

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2009-05-26)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.027

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

刘明浩，Email:8684@163.com