nNOS对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

卢晓梅，于艳秋

（中国医科大学 基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001）

nNOS对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

卢晓梅，于艳秋

（中国医科大学 基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001）

目的 应用神经型一氧化氮合酶nNOS基因缺失小鼠，探讨nNOS对心肌缺血再灌注损伤的影响。方法 野生型C57小鼠和nNOS基因缺失小鼠分别经过冠状动脉左前降支缺血30min再灌注3h，观察TUNEL染色和caspase-8，-9，-3的活性变化，并用Western blot法观察磷酸化p38激酶和胞外信号调节激酶（ERK）的表达情况。结果 心肌缺血30min再灌注3h后，与假手术组相比，TUNEL阳性细胞数增加，caspase-8，-9，-3活性增强，差异有统计学意义（P<0.05）。野生组与基因缺失组相比，凋亡细胞数增多，caspase活性增强，差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示野生型小鼠缺血再灌注损伤后磷酸化p38和ERK激酶活性增强，而基因缺失组p38激酶活性降低，ERK活性不受影响。结论 nNOS具有加重心肌缺血再灌注损伤的作用，其作用可能为p38介导。

缺血再灌注；神经型一氧化氮合酶；丝裂原激活的蛋白激酶

心肌梗死是常见的心血管事件，治疗时恢复血流却可能导致缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IR）［1］。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）通过催化产生NO在调节冠状动脉节律和心肌收缩性方面发挥重要的作用，然而其在缺血再灌注损伤中的作用却颇有争议。大部分数据显示诱导型 NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）或者内皮型 NOS（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在IR时起保护作用［2］，另一些实验却发现iNOS或eNOS起损伤作用［3］。而神经型 NOS（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）虽然在心率、钙循环、钠转运和能量代谢中都发挥重要作用［4］，但在心肌缺血再灌注损伤中的作用还不清楚。

应激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinases，SAPKs）包括胞外信号调节激酶（external-signal regulated kinase，ERK），Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。研究发现，缺血再灌注损伤导致的p38MAPK激活可以诱导细胞凋亡和组织损伤［5］。越来越多的研究证明NO参与SAPKs激活，但是nNOS在缺血再灌注损伤中对SAPKs的激活作用仍不清楚。

本研究应用nNOS基因敲除小鼠探讨了nNOS在心肌缺血再灌注损伤中的作用以及在此过程中SAPKs激活的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组：（1）基因缺失（KO）IR组（n＝9）：12周龄 nNOSKO鼠 （Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA），雄性，体质量 25～30g；（2）野生型（WT）IR组（n＝11）：12周龄 C57BL/6小鼠（Clea，日本），雄性，体质量 25～30g；（3）WT假手术组（n＝9）；（4）KO假手术组（n＝9）。均由日本香川大学医学部提供。

1.1.2 试剂：TUNEL试剂盒（Calbiochem，Darmstadt，Germany）；caspase-3，-8，-9活性试剂盒（Chemicon International Inc.，USA）；抗体（Cell Signaling Technology，USA）；ECL发光系 统 （ECLkit，Amersham Pharmacia，GEHealthcare，UK）；蛋白测定试剂盒（Bio-Rad，USA）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备：苯巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，人工呼吸机辅助呼吸。打开左前胸，暴露心脏。用7/0尼龙丝线在左心耳下方2mm结扎冠状动脉左前降支，显微镜下确认，结扎30min后松开恢复再灌注3h。假手术组打开胸腔暴露心脏，而不结扎动脉。灌注期结束取下心脏。

1.2.2 心肌细胞凋亡的测定：用TUNEL法测定。OCT包裹心脏组织制成4μm冰冻切片，染色。荧光显微镜观察荧光染色。每个标本取3张切片，每片测定10个区域，每个区域计算细胞核的数量以及TUNEL阳性细胞数量。caspase-3，-8，-9活性的检测根据试剂盒说明书进行。

1.2.3 Western blot测定MAPK蛋白表达：利用组织细胞裂解液抽提总蛋白，蛋白测定试剂盒测定组织蛋白含量。取等量的蛋白（50μg）进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜上，phospho-p38、phospho-ERK、总 p38、ERK、β-actin一抗孵育，4℃过夜。二抗孵育1h后，显色系统显色。Western blot条带用NIHImage software分析灰度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 死亡率

假手术组动物无死亡，WTIR组死亡率为27.3%，KOIR组死亡率为22.2%。

2.2 IR诱导的凋亡

TUNEL染色结果显示，WTIR组和假手术组凋亡细胞的阳性百分比为（14.58±0.28）%及（0.59±0.13）%；KOIR组和假手术组凋亡细胞的阳性百分比为（6.24±0.31）%及（0.58±0.15）%，与 WTIR组相比，KOIR组的TUNEL染色凋亡细胞的阳性百分比显著降低（P<0.05）。见图1，2。WT假手术组和KO假手术组caspase-3，-8和-9的活性没有明显差异，而在WTIR组它们的活性分别升至（1.68±0.12）倍、（2.23±0.11）倍和（1.48±0.09）倍，在 KOIR组它们的活性分别升至（1.32±0.06）倍、（1.61±0.09）倍和（1.25±0.08）倍，与WTIR组相比，KOIR组小鼠caspase活性明显降低（P<0.05）。见图3。

2.3 MAPK活性

为了研究nNOS和SAPKs激活在心肌IR中的作用，我们检测了磷酸化p38激酶和ERK，总p38激酶和ERK以及β-actin的表达情况。结果显示，与假手术组相比，WTIR组磷酸化的p38激酶和ERK的表达分别增加（2.00±0.23）倍和（1.50±0.20）倍。尽管与WT假手术组相比，KOIR组磷酸化的p38激酶的表达增加（1.24±0.09）倍，但是却显著低于WTIR组 （P<0.05）。KOIR组磷酸化的ERK也增加至（1.40±0.09）倍，但是与WTIR组相比无统计学意义。见图4，5。

3 讨论

越来越多的证据表明NOS在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，尽管许多研究显示NOS在IR诱导的心肌损伤中起保护作用［6］，然而，也有一些研究显示，心肌缺血再灌注损伤可诱导NO和超氧阴离子作用生成过氧亚硝酸盐，参与急性IR造成的损伤［7］。本研究发现，nNOS加重了小鼠心肌缺血再灌注损伤，可能与以下机制有关：（1）线粒体部位nNOS的激活可以导致一过性线粒体ATP抑制，从而抑制心肌收缩力；（2）心肌肌浆内nNOS激活，肌浆网局部释放NO，在心肌细胞钙离子调节及心肌收缩中发挥重要作用；（3）神经纤维内的nNOS激活降低了心率和氧耗。已有研究证明，nNOS基因缺失小鼠离体心脏梗死率降低，与本研究结果一致。尽管如此，nNOS在心肌缺血再灌注损伤中的确切作用仍然有待进一步研究。

哺乳动物细胞在心肌缺血后会激活一系列信号转导机制，导致心肌细胞不可逆的损伤。研究发现，缺血再灌注损伤可以激活ERK和p38。p38是争议最多的一条信号转导途径，多数研究证明，p38的激活或者发生在缺血时，或者在再灌注期延续时，抑制p38激活可延缓梗死的发展，增加细胞存活率，降低心肌细胞凋亡并增加缺血后心脏功能的恢复［8］。但也有研究发现，在缺血的致死期抑制p38MAPK不会影响IR诱导的损伤程度［9］。许多研究证明，NO参与SAPKs激活，eNOS抑制心肌缺血再灌注损伤时可见p38激酶的激活。本研究结果显示，p38激活在KOIR小鼠降低，说明p38参与了NOS介导的心肌IR损伤。

综上所述，本研究结果表明，在nNOSKO小鼠心肌损伤程度和p38磷酸化程度降低，说明nNOS具有加重心肌缺血再灌注损伤的作用，且该作用与激活p38有关。

［1］Ferdinandy P，Schulz R，Baxter GF.Interaction of cardiovascular risk factors with myocardial ischemia/reperfusion injury，preconditioning，and postconditioning［J］.Pharmacol Rev，2007，59（4）：418-458.

［2］Jones SP，Bolli R.The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection［J］.JMol Cell Cardiol，2006，40（1）：16-23.

［3］Gross ER，Gross GJ.Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：212-221.

［4］Melikian N，Seddon MD，Casadei B.Neuronal nitric oxide synthase and human vascular regulation［J］.Trends Cardiovasc Med，2009，19（8）：256-262.

［5］King LA，Toledo AH，Rivera-Chavez FA，et al.Role of p38and JNKin liver ischemia and reperfusion［J］.JHepatobiliary Pancreat Surg，2009，16（6）：763-770.

［6］Lim SY，Davidson SM，Hausenloy DJ，et al.Preconditioning and postconditioning：the essential role of the mitochondrial permeability transition pore［J］.Cardiovasc Res，2007，75（3）：530-535.

［7］Ji L，Fu F，Zhang L，et al.Insulin attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via reducing oxidative/nitrative stress ［J］.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2010，298（4）：E871-E880.

［8］Sato M，Cordis GA，Maulik N，et al.SAPKs regulation of ischemic preconditioning［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2000，279（3）：H901-H907.

［9］Sanada S，Kitakaze M，Papst PJ，et al.Role of phasic dynamism of p38mitogen-activated protein kinase activation in ischemic preconditioning of the canine heart［J］.Circ Res，2001，88（2）：175-180.

（编辑 王又冬，英文编辑 陈 姜）

Effect of Neuronal Nitric Oxide Synthase on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Mice

LUXiao-mei，YUYan-qiu
（Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of neuronal nitric oxide synthase （nNOS）on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.MethodsIn nNOS-/-（KO）mice and wild type C57（WT）mice，the left anterior descending coronary artery were ligated for 30minutes，followed by 3-hour reperfusion.The cardiac myocyte apoptosis was detected by TUNELstaining，and the activities of caspase-3，-8，and-9and the expressions of phospho-p38mitogen-activated protein kinase（MAPK）and extracellular signal-regulated kinase（ERK）were determined by Western blot.ResultsCompared with control group，the number of TUNELpositive cells and the activities of caspase-3，-8，and-9significantly increased after 30-minute ischemia followed by 3-hour reperfusion （P<0.05）.The number of TUNELpositive cells and the activities of caspase-3，-8，and-9were significantly higher in WTmice than in KOmice （P<0.05）.After ischemia-reperfusion injury，the activities of phospho-p38and ERKincreased in WTmice，but in KOmice，the activity of phospo-p38decreased and the activity of ERKwas unchanged.ConclusionnNOSmay exacerbate ischemia-reperfusion injury，in which p38MAPKmay be involved.

ischemia-reperfusion；neuronal nitric oxide synthase；mitogen-activated protein kinase

R363.2

A

0258-4646（2010）11-0919-03

辽宁省教育厅高校科研基金资助项目（20060946）

卢晓梅（1978－），女，讲师，硕士.

于艳秋，E-mail：yqyu@mail.cmu.edu.cn

2010-05-13