流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8融合病毒的免疫学相关研究

乔莹，才娜，温庆华，蔡鑫泽，韩晓旭，赵连爽，尚红

（中国医科大学 附属第一医院中心实验室，沈阳 110001）

流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8融合病毒的免疫学相关研究

乔莹，才娜，温庆华，蔡鑫泽，韩晓旭，赵连爽，尚红

（中国医科大学 附属第一医院中心实验室，沈阳 110001）

目的 研究用流感病毒反向遗传技术合成的rH5/PR8融合病毒株的免疫学特性，为人工合成的融合流感病毒株，作为疫苗株的免疫性、有效性、稳定性及可持续性提供科学数据。方法 用流感病毒反向遗传技术合成减毒rH5/PR8融合病毒株，用动物实验确认此病毒株的免疫原性、免疫稳定性及免疫防御实验确认防御效果。结果 人工合成的rH5/PR8融合病毒株除HA外，均来自A/PR/8/34（PR8），HA来自H5N1强致病性鸡流感病毒，剪除第346-349的碱性氨基酸（RKKR）部位。用灭活rH5/PR8病毒免疫鸡后，平均抗体水平HITiter达到29以上，持续达1个月之久；免疫原在一定条件下保存2个月及4个月后重复上述实验，抗体水平上升与立即免疫组相似，有效抗体水平可持续到免疫后7个月以上，表明rH5/PR8病毒HA5抗原稳定，不易被降解；免疫防御实验表明：非免疫组鸡的死亡率达到60%左右，而免疫组无死亡，防御率达到100%，表明免疫防御有效。结论 用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合减毒病毒rH5/PR8株，外来基因HA5抗原性安定、免疫原性可靠，有效抗体持续时间长，免疫防御有效。

流感病毒反向遗传技术；流感病毒；强致病鸡禽类流感病毒；疫苗

A型流感病毒（influenza Avirus）流感病毒是危害人类健康的重要病原体，具有单股、负义、分段性RNA病毒，有8个分段RNA基因，携带着10种病毒蛋白，其中HA，NA是病毒表面糖蛋白抗原（图1）［1，2］。由于 HA5型流感病毒非人类特异性敏感株，大部分人类没有HA5抗体存在，1997年香港H5N1型强致病性鸡流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）感染人类，并造成 7人死亡的报道引起了WHO的高度重视，为防止世界规模的大流行，快速有效的疫苗制作及免疫应答的相关研究成为各国紧迫的科研任务［3～5］。

流感病毒反向遗传技术是近年开发的能够及时追踪流感病毒的流行趋势，开发快速有效的流感病毒疫苗株的有效方法［7］。本研究应用流感病毒反向遗传技术，合成人工融合流感病毒（rH5/PR8）。rH5/PR8病毒株除 HA外，NA，NP，PA，PB1，PB2，M，NS基因皆来自PR8；而HA基因来源于H5N1强病毒株，定点突变将第1050碱基从G变为C，使344号氨基酸从碱性氨基酸精氨酸（arginine，R）变为苏氨酸（threonine，T），同时剪除了第 1054到 1065碱基，使346到349号碱性氨基酸部分缺失。测序证明它的HA分子产生了定点突变和基因剪切，并证实了它有良好的增殖性及对鸡呈弱致病性。由于HA5是外来基因并进行了基因剪切处理，因此rH5/PR8病毒株的HA5不但在质而且在量上可能发生了改变，免疫应答反应效果尚未得到确认。本研究旨在对rH5/PR8株免疫原性及免疫防御性进行了进一步的探讨研究，为人工合成流感病毒疫苗株的临床应用提供系统、全面的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF白羽来航鸡及SPF鸡卵均从山东昊泰实验动物繁育有限公司购入。

1.2 实验方法

1.2.1 流感病毒红血球凝集试验及红血球凝集抑制实验：流感病毒红血球凝集试验（HAtiter），与流感病毒抗原强弱呈正相关。以++++的稀释倍数表示HATiter，用PBS作为阴性控制。以HATiter为27阳性病毒免疫实验动物。

红血球凝集抑制试验也称HItiter，与流感病毒抗体强弱呈正相关。以+++以上的血清稀释倍数表示HITiter。

1.2.2 H5/PR8病毒株免疫原有效性实验：将rH5/PR8融合病毒增殖，用甲醛浸泡灭活后，洗净。用HATiter为27的灭活病毒加上免疫佐剂后，免疫10日龄SPF白羽来航鸡各5只，两周后加强免疫1次，每周取血1次，测定HI抗体力价。

1.2.3 H5/PR8病毒株免疫原稳定性实验：操作参考H5/PR8病毒株免疫原有效性实验，制作完成后立即免疫组，与免疫原有效性实验同样完成；同时将免疫原在25℃60%湿度下放置保存2个月及4个月，用保存后免疫原每2个月重复免疫实施一次，共计3次，定期进行采血并进行HITiter抗体价测定。

1.2.4 免疫防御实验（攻击实验）：免疫防御实验是测定疫苗有效性的直接证明，用灭活rH5/PR8病毒0.2ml（HATiter 27）免疫10日龄SPF白羽来航鸡5只，再加强免疫一次（2次免疫组）；免疫21日龄SPF白羽来航鸡5只仅一次（1次免疫组），对照组用PBS代替病毒注射21日龄鸡5只。通过鼻腔接种HPAI0.1ml（106PFU）感染后，对比它们的生存率，确认疫苗株的免疫有效性。并于攻击开始14d后，摘除肝、肺、肾、脑、肠、脾，取各脏器1g用1ml PBS匀浆后，用病毒空斑实验测定上清中有否病毒，确认相应脏器是否有病毒繁殖。

2 结果

2.1 rH5/PR8病毒株免疫原有效性实验

为了明确外源的HA5是否也能象HA1一样在PR8病毒表面表达充分，也就是说免疫原性高低，一般用免疫动物实验来完成。用HATiter 27阳性灭活病毒原液0.2ml，加上免疫佐剂液体石蜡经调和后皮下注射免疫10日龄SPF白羽来航鸡5只，2周后加强免疫一次。每周静脉采血，取血清测定HITiter，对照组用PBS代替病毒原液。免疫组血清抗体HITiter从2周开始增高，7周左右达高峰，HITiter达29以上，持续1个月以上，慢慢开始下降（图2）；对照组未见特异性血清抗体增高（P＜0.05）。

2.2 rH5/PR8病毒株免疫原稳定性实验

免疫抗原制作免疫方法与免疫原有效性实验相同，免疫每2个月重复实施1次。一次性制作的免疫抗原保存在温度252℃，湿度为60%RH5%的条件下，每2个月免疫10日龄鸡5只，二个月后加强免疫1次，定期抽血10倍稀释血清后2倍系列稀释，测定HITiter。表1为rH5/PR8病毒株免疫原安定性实验的具体免疫方法及免疫个体HITiter的变化。免疫抗原作成后立即免疫组，5只鸡平均HI Titer在免疫后2周左右开始上升，2个月时加强免疫一次，3个月左右抗体水平达到高峰HITiter达到27×10，持续1个月左右开始下降，7个月后HITiter为高峰值的1/2；2个月免疫组抗体上升及下降方式与立即免疫组相同；4个月组免疫组抗体上升与前2组无明显差异（P＞0.05），表明免疫原没有因为室温放置保存而降低免疫效果（图3）。

2.3 免疫防御实验（攻击实验）

免疫防御实验是疫苗免疫有效性的直接有效的证明实验方法。用与免疫原性实验同样的方法，免疫10日及21日龄SPF白羽来航鸡各5只，分别进行2次免疫（2次免疫组）及1次免疫（1次免疫组），3周后通过鸡鼻饲接种0.1ml的106PUF的HPAIV（H5N1）病毒，饲育并观察一般状态。接种后一周左右非免疫对照组5只鸡均出现不同程度的临床症状，食欲不振，活动力下降、4只出现体质量下降，10、11日左右 3只鸡陆续死亡（P＜0.05）（图 4）。

摘取心、肝、脾、肾、肺、肠保存，用于测定个脏器病毒量。1次免疫组、2次免疫组均未见明显的临床症状。全部实验动物于病毒接种后14日处死，3只分取脏器用于脏器病毒检测。只有非免疫组个体脏器在肝肺中分离到病毒，约为102～103PFU/ml。免疫组的脏器均未分离到病毒。攻击实验10日取鸡咽头液进行病毒分离，免疫组未分离到病毒，非免疫组有2只鸡分离到病毒（表1）。

表1r H5/PR8疫苗免疫鸡后的攻击实验Ta b.1Immu n e d e f e n s e a s s a y a f t e r t h e c h i c k e n i mmu n i z e d w i t h r H5/PR8Item Age（day） Boost Symptom Virus in pharynx Death rate Virus in organs Organ（PFU/ml）Immunized once 21 - 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） No Immunized twice 10 + 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） No Control group 21 - 80%（4/5） 40%（2/5） 60%（3/5） 40%（2/5） Liver（102-3）

3 讨论

流感病毒由于它的经常变异性，针对当前流行的流感病毒使用适时性的流感疫苗，对预防人类流感流行极为重要，目前使用的人类流感疫苗多为自然分离病毒株，包括：PR8、猪流感疫苗等。近10年来HPAIV株不断造成人类死亡，但是不能使用自然分离的HPAIV病毒株作为疫苗株，原因如下：感染早期致鸡胚死亡，不能产生高滴度病毒；在生产过程中，无法避免对制造者的威胁；生产制造需要P3等特殊设施及设备，造价太高。因此，人工合成能对抗HPAIV的适时性的流感病毒疫苗势在必行。流感病毒反向遗传技术，可以适时性的快速合成人工融合病毒，无疑是合成有针对性的流感病毒疫苗的有用方法之一。到目前为止，人类已经合成包括HA3、HA5、HA7、HA9等外来基因的PR8融合病毒，但并大数多仅对其免疫性进行了探讨［8，9，10］，有待于进一步深入探讨研究。

本研究前期以流感病毒反向遗传技术合成了人工融合病毒株rH5/PR8株，已经验证并报告了其增殖能力可以与自然分离的PR8病毒相比美，外来基因表达稳定，且对自然宿主鸡呈弱毒性。本次研究我们主要针对rH5/PR8的免疫性进行了研究：用免疫原有效性实验、免疫原稳定性实验证明，免疫抗体顺利增高，有效抗体持续时间长，室温条件下放置保存未降低的免疫原性。提示人工合成的融合病毒株rH5/PR8株表面表达免疫抗原HA5数量充分，表达稳定，不易被降解，符合疫苗株的要求。免疫后长时间的抗体水平观察也为了解动物免疫抗体的上升，下降等动态水平变化提供了详尽的数据。

免疫防御实验是确认疫苗株是否有效的直接证明实验，以前多用鼠为实验动物［11，12，13］，但在流感病毒感染生物链条中，鸟类扮演着重要角色。因此，本研究选用鸡作为实验动物，以HPAIV攻击的对照组，鸡的死亡率在60%，出现便血，皮下出血等严重临床症状，脏器及咽喉部都有病毒增殖；相比之下HPAIV攻击免疫组鸡的死亡率为0，无明显临床症状，未从鸡的咽喉液及脏器中分离到病毒，提示用rH5/PR8免疫后的鸡对HPAIV100%免疫防御有效。在2010年最新的研究中，Nayak B等用病毒反向遗传技术将H5N1型HPAIV的HA、NA、M2分别或同时组入 NewscastaleDisease virus（NDVs）病毒株，用攻击实验证实，HA单独表达组有足够的免疫防御能力，这与我们的研究结果相同；而NA、M2同时表达组可以延长生存时间不能增加生存率；M2表达组无免疫防御功能，因此，M2不是中和抗原［14］，该研究结果也间接支持我们使用HA表达的人工融合病毒作为疫苗株的正确性。Ma W等［15］用HPAIV的NS做为外来基因，合成的人工病毒株可以有效地防御H7N1的感染，NS蛋白功能不清，非中和抗原只出现于感染细胞内，不存在于病毒颗粒内，推论NS蛋白与诱导细胞免疫有关。有研究使用其他病毒作为载体，例如：用新城疫病毒代替PR8流感病毒，这样可以使免疫动物“一箭双雕”，但不适合于人类使用，同时由于仅能取向HA或NA，NS等1个或2个基因，不能完全覆盖流感病毒体液免疫和细胞免疫防御。如果用流感病毒反向遗传技术，合成具有当前流行病毒的HA，NA，NS基因的人工融合病毒株，调动机体的体液免疫及细胞免疫两方面因素，防御流行病毒的感染扩散可能是更为有效的防御途径，也是将来流感病毒疫苗开发的方向之一。

综上，本研究用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株rH5/PR8株，除了增殖能力不受影响、遗传稳定性好，对原宿主动物呈弱毒性外，其免疫原性可靠，持续时间长，免疫原稳定，免疫防御有效，证明人工融合病毒株rH5/PR8株作为疫苗候选株是合格的，也为今后用流感病毒反向遗传技术合成可用于临床的人类的流感疫苗病毒株提供了可靠的数据。

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（编辑 孙宪民，英文编辑 陈 姜）

Immunological Characteristics of Syncytial Virus Strain rH5/PR8Generated by Reverse Genetics System for Influenza Virus

QIAOYing，CAINa，WENQing-hua，CAIXin-ze，HANXiao-xu，ZHAOLian-shuang，SHANGHong
（Central Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the immunological characteristics of the syncytial virus strain rH5/PR8generated by plasmid-based reverse genetics system for influenza virus，and to provide evidence for the immunity，effectiveness，stability，and persistence of the virus as a vaccine candidate.MethodsrH5/PR8，an attenuated influenza virus strain，was generated by plasmid-based reverse genetics system.Animal experiment was performed to confirm the immunity，stability，and immune defense of the virus.ResultsThe transfectant influenza virus strains of rH5/PR8were all generated from A/PR/8/34（PR8）except for HA，which was from highly pathogenic avian influenza virus（HPAIV）H5N1with the removal of basic amino acid（RKKR）motif in the connecting peptide from 346to 349.The mean HItiter of antibody from chickens immunized with inactivated rH5/PR8was over 29and lasted for 2months.The immunogen was kept for 2to 4months and used in repeated experiments.In repeated experiments，the antibody level was similar，and the effective antibody level lasted for over 7months after immunized，which indicated that HA5antigen of rH5/PR8virus was stable.The immune defense showed that the mortality of the chickens reached 60%in non-immune group，while none died in immune group，suggesting that the immune defense was effective.Conlusion The exogenous gene HA5from influenza virus rH5/PR8generated by plasmid-based reverse genetics system has reliable immunogenicity and stable antigenicity.The antibody level can last for a long time，indicating an effective immune defense.

reverse genetics；influenza；highly pathogenic avian influenza virus；vaccine

O657.72；Q523

A

0258-4646（2010）11-0891-04

教育部留学归国启动基金［教外司留（2009）8］

乔莹（1962-），女，讲师，博士.

尚红，E-mail：hongshang100@hotmail.com

2010-09-02