p-[18F]FSTC的合成和初步动物学评价

郭飞虎，施玲丽，王 妮，武明星，张勇平，杜 进，4，*,张 岚,*

1.中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京 102413； 2.中国科学院 上海应用物理研究所 放射性药物研究中心，上海 201800；3.复旦大学 附属肿瘤医院 核医学科 PET中心，上海 200032；4.中国同位素公司，北京 100045

肿瘤乏氧现象普遍存在于多种实体肿瘤内，是导致放疗和化疗失败的主要因素之一[1-2]，且易使肿瘤发生远处转移[3-4]。正电子断层显像(PET)在肿瘤乏氧检测中的应用依赖于对肿瘤乏氧具有特异性的PET分子探针的开发。18F标记的硝基咪唑类化合物18F-FMISO[5-6]和18F-FAZA[7]以及64Cu标记的64Cu-ATSM[8-9]的研究在不同程度上取得了一定成功[10]。其中18FMISO是第一个用于临床诊断研究的乏氧组织显像剂。但目前18FMISO乏氧显像仍有不足之处，主要包括：(1) 由于体内组织有较低的18FMISO吸收率，使病灶与正常组织的吸收比不理想；(2) 正常组织对这类示踪剂的细胞清除率慢，延误成像并影响图像质量；(3) 由于18FMISO具有较高的亲脂性，所以存在一定程度的神经毒性。这些因素均妨碍了其临床应用[11]。

乏氧会在肿瘤内诱导产生一系列的生理、生化变化。在乏氧环境中，乏氧诱导因子1(HIF-1)含量的变化可引起肿瘤细胞内多种基因的高表达[12]，碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ，CA Ⅸ)即是这些HIF-1的靶基因之一。作为碳酸酐酶的一个亚型，CA Ⅸ是一种跨膜蛋白，其活性位点在细胞膜表面，其主要生化作用是催化二氧化碳-碳酸的可逆反应，和通过高度糖酵解产生的乳酸而降低肿瘤细胞pH值，使其酸化，从而提高肿瘤细胞的生存几率和抵抗放射或化学治疗的效果[13]。CA Ⅸ在人体内大多数正常组织中没有表达或表达很低，而在通过HIF-1诱导的多种实体肿瘤中有高度的表达(前列腺除外)，如子宫颈癌、头颈部瘤、乳癌、肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤等[14]。这些性质使CA Ⅸ作为一种肿瘤乏氧的内源性标志物，是一个非常具有前景的肿瘤分子显像诊断的靶点，并且磺胺类药物对CA Ⅸ有很好的靶向性。因此，结合一些CA Ⅸ特异性的磺胺类分子探针通过PET显像对肿瘤乏氧进行检测是一种可靠、无创、方便的方法。这对肿瘤的早期诊断、准确分期、监测复发和转移以及协助确定肿瘤治疗方案，以提高肿瘤治疗的效果、降低死亡率具有重要的现实意义和应用价值。

Chrastina等[15]的研究表明，125I标记的CA Ⅸ单克隆抗体M75在经24 h乏氧气氛培养后的HT-29、HeLa、SiHa等肿瘤细胞内的摄取比正常培养的细胞显著增高，生物体内分布实验显示125I-M75在HT-29肿瘤内特异性浓集，与CA Ⅸ在肿瘤内的高水平表达一致。111In标记的另外一种CA Ⅸ抗体G250也在荷瘤小鼠模型体内取得了类似的结果[16]。但由于大分子抗体在体内缓慢的药代动力学过程，使得标记的抗体需24 h甚至更长时间才能完成与细胞上CA Ⅸ的结合，此外单抗价格昂贵，这些因素限制了它们作为分子显像探针在临床上的应用。另外，体内广泛分布并和CA Ⅸ有竞争的CA Ⅰ和CA Ⅱ主要分布于细胞内，而CA Ⅸ是一种跨膜蛋白，其活性位点在细胞膜表面，如果CA Ⅸ分子探针的亲脂性高，会导致探针通过细胞膜，和细胞核内部的CA Ⅰ和CA Ⅱ结合。因此理想的CA Ⅸ分子探针应该具有良好的亲水性，和CA Ⅸ有特异性结合，并且能够方便快速的合成。

意大利Vullo,Garaj等人合成并筛选出一系列磺胺类CA Ⅸ抑制剂，其中一些化合物如2,3,5,6-四氟-3’-磺酰胺基苯酰替苯胺[17]、2,4-二甲氧基-6-[(4-磺胺基苯)甲基胺基]-1’，3’，5’-三嗪[18]、2,4-二甲氧基-6-[(4-磺胺基苯胺基)]-1’,3’,5’-三嗪[18]、2,4-二氯-6-[(4-磺胺基苯胺基)]-1’,3’,5’-三嗪[18]，均在实验中显示了高CA Ⅸ抑制能力(Ki<1 nmol/L)和高选择性(抑制能力是对CA Ⅱ的26～706倍)。Wilkinson等[19]将带端炔基的磺酰胺与带叠氮基团的糖通过点击化学方法(click chemistry)得到一系列的化合物，实验表明其中化合物(3S，4S，5S，6R)-3，4，5-三羟基-6-(4-((4-磺胺基苯胺基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯((3S,4S,5S,6R)-methyl 3,4,5-trihydroxy-6-(4-((4-sulfamoylbenz amido) methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl) tetrahydro-2H-pyran-2-carboxylate)有相对较高的CA Ⅸ抑制能力(Ki=23 nmol/L)和选择性(抑制能力是对hCA Ⅱ、Ⅻ和ⅩⅣ的16.4、16.8和4.6倍)。武明星等[20-22]合成了可能具有高亲和力和选择性的CA Ⅸ抑制剂,其中化合物4-{[4-(2-氟乙氧基)-6-(2-羟基乙氧基)-1，3，5-三嗪-2氨基]甲基}苯磺酰胺对CA Ⅸ有较好的抑制能力，抑制常数为9.6。并且尝试合成了18F标记的化合物4-[4-(2-氟[18F]乙氧基)-6-(2-羟基乙氧基)-1,3,5-三嗪-2-亚胺基]苯磺酰胺，但是标记率不是很理想，仅为5%。

1 实验仪器及材料

AVANCE 400 MHz(或300 MHz)核磁共振仪，瑞士Bruker公司，选用TMS为内标，化学位移值以δ值表示;AVATAR370 FTIR红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司；GC CP3800-MS Saturn2100气质联用分析仪，美国Varian公司；RE-52-2型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；MicroMass GCT CA 055质谱仪，美国安捷伦科技公司；放射性薄层扫描仪(Radio-TLC)，德国Merck公司；SN-697全自动双探头放射免疫伽马计数仪，上海应用物理研究所日环光电仪器有限公司；旋风30型回旋加速器，比利时IBA公司；FJ-391A2型微机放射性活度计，北京核仪器厂；高效液相系统 Dionex P680 summmit HPLC分析系统，美国Dionex公司，HPLC柱为LoChrosorb C18，分为2种，分析柱：10 μm,300 mm×3.9 mm；半制备柱：10 μm，300 mm×7.8 mm；C18 plus Sep-Pak Cartridge柱，美国Waters公司；季铵型阴离子交换柱(quarternary methylamine column,QMA柱)，美国Waters公司。

对溴苯磺酰氯、2-甲基-3-丁炔-2-醇、4-二甲胺基吡啶(DMAP)、抗坏血酸钠，日本TCI化学试剂公司；对氨基苯磺酰胺、间氨基苯磺酰胺，比利时Acros化学试剂公司；4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，吉尔生化试剂有限公司；对甲基苯磺酰氯、三苯基膦二氯化钯，美国Aldrich化学试剂公司；乙二醇，上海云翔化工有限公司；2-氟乙醇，上海元吉有限公司；4,7,13,16,21,24-六叠氮-1,10-二唑双环酮K222(Kryptofix 222)、无水乙腈，比利时Acros公司；无水DMSO，美国Fluka化学试剂公司。除特别说明外，所有的商品化试剂使用前均未进一步纯化处理。

昆明小鼠21只，每只约20 g，购于中国科学院上海实验动物中心。

药代动力学计算软件DAS 2.0，芜湖高斯数据分析有限公司提供。

2 p-[18F]FSTC的合成

p-[18F]FSTC合成路线示于图1。

图1 p-[18F]FSTC的合成路线Fig.1 Synthesis of p-[18F]FSTC

2.1 乙二醇二对甲苯磺酸酯(化合物2)的合成

向用冰浴冷却的乙二醇(2.8 mL，50.0 mmol)、三乙胺(34 mL，250 mmol)和4-二甲胺基吡啶(0.3 g)的二氯甲烷(120 mL)溶液中，缓慢滴加对甲苯磺酰氯(24 g，125 mmol)的二氯甲烷(80 mL)溶液，0 ℃搅拌30 min后，室温下搅拌过夜，蒸去二氯甲烷，硅胶柱纯化得到淡黄色固体。

5.犊牛地方流行性肺炎。也叫运输热或称运输热肺, 是由多种病原微生物所引起犊牛的一种急性呼吸道传染病。以发热、流鼻液、急性肺炎和纤维素性胸膜炎为特征。

2.2 2-叠氮乙基对甲苯磺酸酯(化合物3)的合成

向化合物2(3.7 g，10 mmol)的无水DMF(20 mL)溶液中，分批加入叠氮化钠(0.65 g，10 mmol)，室温反应48 h，过滤，滤液倒入200 mL水中，再用3×30 mL乙酸乙脂萃取，经饱和食盐水洗涤、硫酸钠干燥后除去溶剂，硅胶柱纯化得到淡黄色油状物。

2.3 [18F]氟离子的生产和活化

[18F]F-由上海市复旦大学附属肿瘤医院提供，具体生产条件如下：采用核反应18O(p，n)18F，应用小体积(1.5 mL)H2O[18O]富氧水(95%)靶，在回旋加速器上用质子束流连续轰击15～60 min，得到的[18F]F-富集在QMA柱上，由1 mL含K222和K2CO3的溶液洗脱得到[18F]F-溶液。100 ℃下氮气流中共沸蒸干后直接用于反应。

2.4 2-[18F]氟叠氮乙烷的制备

向活化后含有[18F]F-的反应瓶中，加入2-叠氮乙基对甲苯磺酸酯(5 mg，20.7 μmol)的300 μL无水乙腈的溶液，90 ℃反应15 min，将反应体系用冰水浴冷却到室温，通过TLC检测反应进展情况(流动相：乙酸乙酯，Rf=0.88)。该体系不做分离直接用于下一步反应。

2.5 p-[18F]FSTC的制备

氮气保护下，向100 μL 0.10 mol/L pH=6.0磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，依次加入50 μL 0.45 mol/L硫酸铜溶液和100 μL 1.50 mol/L抗坏血酸钠溶液，4-丙炔酰胺基苯磺酰胺(5 mg，22.3 μmol)的150 μL DMF和100 μL t-BuOH溶液，上一步制备的2-[18F]氟叠氮乙烷的乙腈溶液300 μL。在35 ℃反应15 min后加10 mL水稀释，Sep-Pak C-18柱纯化得粗产物后，再用半制备HPLC柱来纯化目标产物(流动相是水和乙醇梯度淋洗，流速为1.5 mL/min，UV(254 nm)检测和放射性检测，接收19.2～23.2 min之间的组分，蒸掉溶剂后，用50 μL乙醇和2 mL 9%生理盐水溶解)。

2.6 p-[18F]FSTC注射液的质量控制

上述溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤灭菌后得到[18F]FSTC注射液，肉眼观察其外观性状，HPLC分析柱分析检测(流动相由纯水(流动相A)和乙腈(流动相B)两相组成，经过UV(254 nm)检测器和放射性检测器，梯度分离条件为：0 min，5% B；5 min，5% B；10 min，38%B；25 min，38%B；30 min，5% B。流速为1 mL/min。保留时间为14 min)。

2.7 p-[18F]FSTC的体外稳定性测试

磷酸盐缓冲液(PBS)法：取100 μL (3.7 MBq)p-[18F]FSTC注射液，置于1 mL pH=7.24、0.02 mol/L PBS中，37 ℃孵育30、60、120、180 min后，采用Radio-TLC(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1)法测定其放射化学纯度，以观察其体外稳定性。

小牛血清(BS)法：取100 μL (3.7 MBq) p-[18F]FSTC注射液，置于1 mL小牛血清BS中， 37 ℃孵育30、60、120、180 min后，依次取100 μL混合液，加入100 μL乙腈，涡旋1 min，4 ℃ 13 500 r/min条件下离心10 min，取上清液用Radio-TLC(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1)测定其放射化学纯度，以观察其体外稳定性。

2.8 p-[18F]FSTC的脂水分配系数(lg P)的测定

取5 μL [18F]FSTC制剂于5 mL vial(含有1 mL 1-octanol和1 mL pH=7.24 0.02 mol/L PBS)，密封好，在室温下涡旋10 min，静置至两相平衡。依次取出有机相和水相各500 μL置于γ计数管中，用γ计数器测定计数。重复3次，据下列公式，计算得到p-[18F]FSTC的平均lgP值。

lgP=lg (有机相中计数/水相中计数)

3 p-[18F]FSTC初步生物学评价

3.1 体内脱氟稳定性实验

将约3.7 MBq/100 μL p-[18F]FSTC生理盐水，经尾静脉注射到9只小白鼠体内(每只约20 g)，分别于注射后30、60、120 min时眼眶取血。血液收集到50 μL肝素化的指型管中，立即离心分离(13 500 r/min，4 ℃)5 min，得到约300 μL上清液，加入等量的乙腈，涡旋2 min，然后再离心分离(13 500 r/min，4 ℃)5 min，得到约400 μL上清液，通过Radio-TLC (V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1)测定其放射化学纯度，以观察其体内脱氟稳定性。

3.2 血液清除实验

将约3.7 MBq/100 μL p-[18F]FSTC生理盐水，经尾静脉注射到3只小白鼠体内，分别于注射后1、3、5、10、15、30、45、60、90、120 min时断尾，用移液枪准确移取5 μL血样，置于计数管底部，测放射性计数(N)，用N0=Nt×exp(0.006 32t)校正后绘制每5 μL血液中的计数-时间关系曲线。用药代动力学计算软件DAS 2.0计算其药代动力学参数。

3.3 正常鼠体内分布实验

将约3.7 MBq/100 μL p-[18F]FSTC生理盐水，经尾静脉注射到9只正常小白鼠体内，分别于注射后60、120、180 min时处死，取心脏、肝脏、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、骨头、血、脑、甲状腺等相应器官置于事先称量好的计数管底部，称重，测量计数经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。

4 结果和讨论

4.1 p-[18F]FSTC的放化合成和质量控制

首先由对甲苯磺酸-2-叠氮乙酯经亲核取代18F标记得到2-叠氮-1-[18F]氟乙醇，再和4-丙炔酰胺基苯磺酰胺在Cu(I)作用下通过点击化学两步反应最终合成p-[18F]FSTC。

合成过程中得到化合物2(淡黄色固体)12 g，收率65%；Rf=0.73(展开剂：V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶2)；熔点120.8～121.4 ℃；IR (KBr，ν)：3 432、2 970、2 940、1 601、1 373、1 364、1 176、1 095、1 033、1 010、915、804、772 cm-1。得到化合物3(淡黄色油状物)0.69 g，收率28.8%；

合成总共花费时间约为60 min，第一步反应用放射性TLC分析显示标记率为90%，第二步点击化学反应几乎100%反应。衰变校正后总放化产率54.2%。p-[18F]FSTC注射液放化纯度大于98%，外观为无色澄清透明液体。

4.2 p-[18F]FSTC的体外稳定性测试

4.2.1体外稳定性实验(PBS法) p-[18F]FSTC在pH=7.24 0.02 mol/L PBS缓冲溶液中于37 ℃下孵育3 h后放化纯度(RCP)没有明显变化，仍然大于98%(图2a)。

4.2.2体外稳定性实验(BS法) p-[18F]FSTC在小牛血清中37 ℃下孵育3 h后放化纯度没有明显变化，仍然大于98%(图2b)。

图2 p-[18F]FSTC的体外稳定性Fig.2 Stability of p-[18F]FSTC in vitro(a)——pH=7.24 0.02 mol/L PBS，(b)——BS

4.3 p-[18F]FSTC的lg P测定值

p-[18F]FSTC的脂水分配系数lgP=-0.016±0.013。

4.4 体内脱氟稳定性实验结果

图3为p-[18F]FSTC在小鼠体内的稳定性研究结果。由图3结果可知，p-[18F]FSTC注入小鼠体内3 h后，Radio-TLC分析显示放化纯度仍然大于97%，说明该药物在体内不易脱氟。

图3 p-[18F]FSTC在小鼠体内的稳定性研究Fig.3 Stability of p-[18F]FSTC in vivo

4.5 血液清除曲线

p-[18F]FSTC血液清除曲线示于图4。由药代动力学计算软件DAS 2.0双室模型给出的分布相和清除相半衰期分别为t1/2α≈2 min，t1/2β≈99 min(n=3)。以上数据表明该探针能迅速分布到全身，但在血中滞留时间较长。

图4 p-[18F]FSTC血液清除曲线Fig.4 Curve of blood clearance of p-[18F]FSTC

4.6 正常鼠体内分布实验

p-[18F]FSTC在正常小鼠体内各器官的分布

数据列于表1。由表1数据可知，p-[18F]FSTC在血液中的浓度很高，60、120、180 min时的放射性摄取依次为59、44、42。说明该药物在血液中清除非常缓慢，这可能会造成模型鼠Micro-PET显像时非靶组织摄取过高，效果不理想。其次在脾、肺、肾、胃中的吸收也比较高。p-[18F]FSTC在胃中的高吸收与CA Ⅸ在胃肠道中的较高表达[14]相一致。在今后的研究中如果能在p-[18F]FSTC结构的基础上引入羧基、羟基等一些亲水性基团，以提高探针的水溶性，增强和CA Ⅸ的特异性结合，可能会获得更为理想的分布及显像效果。

表1 p-[18F]FSTC在正常小鼠体内分布Table 1 Biodistribution of p-[18F] FSTC in normal mice

注(Note)：n=3

5 结 论

本课题为研究开发一种适合18F标记的用于CA Ⅸ检测的特异性PET探针，快速高效的合成了PET探针p-[18F]FSTC。p-[18F]FSTC在体内外都非常稳定，正常小鼠体内分布结果显示其在血液中的清除很慢，在脾、肺、肾、胃中的摄取较高。本工作为进一步研制开发针对CA Ⅸ的肿瘤乏氧显像PET探针提供了实验依据。

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