急性胰腺炎病人免疫功能的变化与细菌移位及大黄干预的关系*1

姜良富 张广聚

(1.临沂市人民医院外一科，山东 临沂 276000； 2.临沂市兰山区半程卫生院，山东 临沂 276000)

急性胰腺炎( acute pancreatitis，AP) 是腹部外科常见病，其中，重型急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)起病急骤、病情凶险，尽管进行了许多研究和改进，但其死亡率仍然高达10%～20%左右[1]。最近的研究提示，免疫异常在AP的病情恶化中起着关键作用，越来越多的学者认为AP的发病和免疫异常有关。 急性胰腺炎发病后期胰腺和胰周的继发感染成为影响急性胰腺炎死亡率的首要因素[2]， 肠道细菌移位造成胰腺感染，这一观点被大量实验结果所证实。本研究采用Wistar大鼠经胰管逆行注入5%牛磺胆酸钠溶液复制SAP模型，用流式细胞仪检测SAP大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的变化并取血液、胰腺和肠系膜淋巴结进行细菌培养，研究急性胰腺炎时细菌移位发生情况，为急性胰腺炎治疗提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠，雌雄不限，山东大学动物室提供。牛磺胆酸钠(Sigma公司)。荧光标记抗体: CD4-FITC、CD8-PE (eBioscience,Canada)。流式细胞仪(Becton Dickinson，America)。精制大黄素片(上海香山中医院)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型制备 健康Wistar大鼠30只，随机分为3组, SAP模型组(M组，n=10)、大黄治疗组(T组，n=10)和假手术组(SO组，n=10)。动物术前禁食12 h，禁水6 h。3%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射(30 mg·kg-1)麻醉，采用上腹壁正中切口入腹，寻及十二指肠及胰胆管，用一小动脉夹夹闭胆管近肝端，1号丝线结扎胰胆管近肠端，并用41/2#皮试针头刺入胰胆管肠端，M组以0.2 ml·min-1的速度向胰胆管内逆行推注5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 ml·100 g-1)。T组按M组方式复制SAP模型，关腹后即刻给以大黄素溶液1 ml(5 ml·100 g-1) 注入胃内。SO组以0.2 ml·min-1的速度向胰胆管内逆行推注生理盐水(0.1 ml·100 g-1)后关腹。术后24 h，行颈动脉插管，抽血3 ml作细菌培养及流式细胞仪检测，剖腹切取胰腺及肠系膜淋巴结作细菌培养。

1.2.2T淋巴细胞亚群检测 采血样1.8 ml，加预先配制的肝素抗凝剂0.2 ml混匀。取专用试管2支，各管依次加入CD4-FICT及CD8-PE单克隆抗体各20 μl及肝素抗凝血100 μl,充分混匀，避光保存10 min,2000 r/min离心5 min，弃上清；用PBS洗涤3遍，加入PBS 0.5 ml。样本在流式细胞仪(FCM)上进行检测。

1.2.3胰腺及肠系膜淋巴结组织细菌培养 将取下的胰腺坏死组织及肠系膜淋巴结(MLN)各0.1 g,加入1 g无菌生理盐水，在无菌塑料袋内研磨成匀浆，分别取50 μl 接种于BAP、MAC，36℃培养18～20 h。培养48 h无细菌生长为无细菌生长。凡有一个菌落形成者为阳性。

1.2.4血液细菌培养 取血液2 ml注射入胰胨大豆胨培养液中，然后放入36℃培养箱中培养，疑有细菌生长时转种BAP、MAC，36℃培养18～24 h后。培养48 h无细菌生长，为无细菌生长。凡有一个菌落形成者为阳性。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 动物一般情况

大鼠苏醒后，SO组一般情况良好； M组大鼠精神萎糜、卷曲、不愿活动，有的不能站立，反应差，全身肌张力低。T组大鼠精神状态及其他状态较M组好，但较SO组差。

2.2 血中CD4、CD8阳性细胞数以及CD4+/CD8+变化

用FCM测定各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群，发现M组大鼠血中CD4阳性细胞数及CD4+/CD8+比值明显下降，显著低于SO组和T组(P<0.01,P<0.05)，见表1。

表1 CD4+、CD8+浓度以及CD4+/CD8+的变化

注： 与SO组比较，#P<0.01，*P<0.05；与M组比较，△P<0.05。

2.3 胰腺、血液及肠系膜淋巴结细菌培养结果

M组血及脏器细菌培养阳性率较高，明显高于T组及SO组。T组阳性率显著低于M组。见表2。

注：与SO组比较，#P<0.01；与T组比较，*P<0.05。

3 讨 论

AP的启动及病情演变机制十分复杂，除胰酶激活自身消化胰腺的损伤机理外，粒细胞过度激活，细胞因子的“瀑布反应”等均参与了AP 的发生与发展的过程[2]。最近的研究提示，免疫异常在AP的病情恶化中起着重要作用，越来越多的学者认为AP的发病和免疫异常有关。T淋巴细胞亚群是构成机体免疫系统的重要成分,体内通过辅助性T细胞CD4+和抑制性T细胞CD8+形成的T细胞网络以维持调节免疫功能的平衡[3],二者的升高与降低,均可使两者的比例失调,导致机体免疫功能的异常或紊乱[4]。本实验中发现，M组CD4阳性细胞百分比和CD4+/CD8+的比值均较正常对照组明显降低，统计学分析有显著性差异。同时发现M组CD8阳性细胞百分比没有下降，与正常组相比无显著差异。 以上结果表明SAP早期时，不仅胰腺炎症改变严重，而且还存在明显的细胞免疫功能紊乱。一方面表现为免疫抑制因素(CD8+)的数量变化不大；而另一方面表现为细胞免疫功能的降低(CD4+和CD4+/CD8+降低)。其主要原因可能是SAP病程中组胺、缓激肽和许多细胞因子的变化对免疫系统具有抑制作用。

SAP继发胰腺及胰周感染是SAP最常见和最严重的并发症，其死亡率可高达80%[5]。本研究中M组血及脏器细菌培养阳性率较高，而SO组动物只有两只在肠系膜淋巴结(MLN)培养出细菌，其它脏器及血培养均为阴性。检测出的细菌种类绝大多数为大肠杆菌。可见移位细菌主要是革兰氏阴性杆菌，与肠道内菌群一致。以上结果表明SAP时肠道黏膜屏障破坏，肠壁通透性增加，从而引起肠道内细菌移位。本实验发现，三组动物中肠系膜淋巴结细菌培养阳性率最高，M组、T组细菌培养血液及胰腺阳性率较淋巴结低，且较接近。说明由于肠菌的过度繁殖，使细菌侵入淋巴道，移位至肠系膜淋巴结，淋巴道可能是细菌最重要以及最早的侵袭途径。然后沿淋巴结发生血行播散引起胰腺和全身感染。本研究显示M组CD4阳性细胞数和CD4+/CD8+比值明显降低，肠系膜淋巴结、血及胰腺细菌培养阳性率较高。相反经大黄治疗的T组血CD4阳性细胞数和CD4+/CD8+比值明显高于M组，而MLN、血及脏器细菌培养阳性率明显低于M组。表明 SAP时全身的免疫功能下降，与肠细菌移位有关，可能是胰腺胰周感染的主要原因之一。而机体细胞免疫功能的下降为感染的发生提供了条件。

祖国医学本着六腑以通为用的基本理论，采用大黄等泻下药物治疗急性胰腺炎，己取得显著的临床治疗效果[6]。本研究发现，经大黄治疗后的T组动物精神状态等一般情况较M组好， T组血CD4+阳性细胞数和CD4+/CD8+比值明显高于M组，MLN、血及脏器细菌培养阳性率明显低于M组；表明大黄可以通过增强机体的细胞免疫功能调节免疫功能紊乱，从而减少细菌移位，发挥保护肠黏膜屏障的作用，对SAP有一定的治疗作用。

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