PTPN22单核苷酸多态性与类风湿关节炎关系的研究*

柏素云 张立民 王翠香 杨志孝 张 丽 方 茜

(1.泰山医学院生化教研室, 山东 泰安 271000; 2.泰山医学院附属泰山医院风湿免疫科, 山东 泰安 271000; 3. 泰山医学院分析实验室,山东 泰安 271000)

类风湿关节炎(RA)是一种常见的全身性自身免疫性疾病，全世界成人患病率约1%，该病以关节滑膜的增殖性炎症为特征，最终导致关节畸形和关节功能障碍。对于RA的病因目前尚不十分清楚，可能与遗传因素、环境因素、精神因素、感染等多种因素有关。其中遗传因素是导致该病易感性的主要因素(约占60%)。最近，有研究表明蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(PTPN22)基因1858C->1858T (rs2476601)单核苷酸多态(SNP)与RA有关，但在不同地域人群中的报道不一。本研究运用PCR-RFLP技术检测PTPN22基因1858位点的基因型，探讨该位点的变异与中国泰安地区汉族人群RA易感性之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集根据美国风湿病协会1987年修订的RA分类诊断标准确诊的128例RA患者，其中男性30例，女性98例，患者年龄15～64岁；正常对照组142 例，系健康体检者，其中男性31例，女性111例，年龄18～57岁。全部研究对象来自山东泰安地区汉族人群，相互之间无血缘关系。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA的提取 取受检者静脉血200 μl，以乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝并置-70 ℃保存。使用吸附柱方法从血液中提取基因组DNA(TIANamp Blood_血液基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技北京有限公司)。

1.2.2PCR扩增 参照文献[1]设计引物，F:5′-ACT GAT AAT GTT GCT TCA ACG G-3′,R: 5′-TCA CCA GCT TCC TCA ACC AC-3′。引物购于上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR扩增试剂盒购于宝生物工程大连有限公司(TaKaRa PCR Amplification Kit)。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 54 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s,共40个循环; 72 ℃延伸5 min。

1.2.3基因型分析 PCR产物以限制性内切酶 RsaI (New England Biolabs)酶切后2.5%琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)，根据电泳结果判定每个个体的基因型。

1.2.4统计分析 根据基因型计算等位基因频率，检验其是否符合Hardy-Weinberg平衡，各基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

基因型电泳结果：含1858C等位基因的PCR产物可被RsaI限制性内切酶切割产生176 bp和42 bp两个片段，含突变的1858T等位基因的PCR产物不能被切割，因此只产生一个218 bp的片段。电泳结果显示受检测的128例RA患者和142例健康对照者PTPN22的1858位点全部为C等位基因，未检测到T等位基因。电泳结果见图1。

图1 PTPN22基因型电泳结果

M:Marker;1～7:C/T, 其中42 bp的小片段在图中未显示。

3 讨 论

遗传因素是导致RA易感性的主要因素(约占60%),长期以来，对该病易感基因的研究主要集中在人类白细胞抗原(human leucocyte antigen ，HLA)上，已发现RA与HLA-DRB1有很强的相关性。然而HLA位点在RA发病的家族聚集性中所发挥的作用只有约1/5～1/3[2]。因此近年来，许多学者将对RA易感基因的研究转向HLA位点之外。

PTPN22现被认为是除了主要组织相容性抗原复合物(MHC)以外最重要的自身免疫性疾病危险因子。PTPN22基因位于1号染色体短臂(1p13.3-p13.1)，编码一种淋巴样特异性磷酸酶(lymphoid-specific phosphatase ，LYP)。LYP的磷酸酶活性能使T细胞中的酪氨酸激酶Lck的已磷酸化(有活性)的394位酪氨酸去磷酸化从而负性调节T细胞受体(TCR)信号转导。除了Lck以外，LYP还能结合一些其他的参与TCR信号转导的分子包括Zap70、 CD3ε和TCRζ链并使之去磷酸化(无活性)从而下调TCR信号转导。另外，LYP还通过C端一个富含脯氨酸的模序与酪氨酸激酶Csk(C-terminus Src kinase，Csk)的SH3结构域结合。Csk能使Lck的505位酪氨酸磷酸化从而抑制Lck的活性。因此，Csk与LYP结合后能使Lck丧失激酶活性。PTPN22基因1858C->1858T (rs2476601)单核苷酸多态使第620位密码子编码的氨基酸从精氨酸变为色氨酸，导致LYP和Csk的结合部分或完全被破坏，并且增加了LYP的内在酶活性，从而使得一些重要的信号分子的磷酸化程度降低和相关的TCR信号转导下调，失去了对T细胞活化的抑制作用[3-4]。大量研究表明这种变异与多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎、青少年类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、Ⅰ型糖尿病、Grave’s病等的发病相关[5]。PTPN22 1858T变异与RA的易感性、疾病进展速度和严重性之间有重要联系。Begovich等[6]于2004年首先报道PTPN22 1858T变异在北美人群中与RA易感性有关。随后的大量研究一致表明该变异与北美、欧洲血统人群包括西班牙[7]、加拿大[8]、英国[9]、芬兰[10]、北美[11]、瑞典[11]、德国[12]、荷兰[13]的RA有关。但在我们的研究中未发现PTPN22 1858T变异，这与欧洲及北美人群中存在一定频率的该等位基因并且与RA易感性有关的结论不同。Ikari等[14]对1124例日本RA患者和453例健康对照者的研究发现PTPN22 1858T等位基因频率极低(无论RA患者还是健康对照者的频率都是0.0022)，这一结果与我们的研究结果相似。这种结果的出现可能由地域和人种之间的差异所致，而在亚洲人群中该位点的突变率可能极低。Kawasaki等[15]报道PTPN22 启动子区多态位点rs2488457(1123G>C)的杂合子基因型与日本和韩国人1型糖尿病的急性发病有关。于志云等[16]的研究表明PTPN22基因 -1123G>C SNP与我国人群自身免疫甲状腺病相关。这说明进一步研究PTPN22 基因其他多态位点与自身免疫病包括类风湿关节炎的关系，有助于评价PTPN22 基因与中国人群类风湿关节炎的关系。

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