风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

赵立红

(泰山医学院附属泰山医院检验科，山东 泰安 271000 )

风疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜，引起上呼吸道炎症。风疹病毒感染最严重的问题是孕妇感染可导致对婴儿的先天性损害，尤其前3个月感染风疹病毒，可通过胎盘感染胎儿，导致孕妇流产、死胎，或新生儿一系列的器官畸形等先天性风疹综合症(congenital rubella syndrome，CRS)[1]。为了尽早检测临床标本中风疹病毒，避免出生缺陷，本研究建立了风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)方法，并构建了RV实时荧光定量RT-PCR参考标准，为临床应用中风疹诊断提供简便、快捷、准确、定量的检测方法。

1 材料与方法

1.1病毒株、质粒、试剂与仪器 风疹病毒疫苗RA27/3株购自泰安市疾控中心。质粒pET30a(+)由山东大学医学院病原生物学研究所赵蔚明教授惠赠。Taq DNA 聚合酶、逆转录酶AMV-RT购自Takara公司。UNIQ-10柱式总RNA抽提纯化试剂盒、SK1191 UNIQ-10柱离心式质粒DNA小抽试剂盒均购自上海生物工程有限公司。E.Z.N.A. DNA凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司。其他常规试剂均为国产分析纯。T-1型热循环仪为德国Biometra公司产品。尤尼柯紫外可见分光光度计为上海尤尼柯仪器有限公司。PE7300实时荧光定量PCR扩增分析仪为美国ABI公司产品。

1.2定量标准品的制备

1.2.1风疹病毒疫苗RA27/3株RNA的制备及cDNA合成 UNIQ-10柱式总RNA抽提纯化试剂盒提取风疹病毒疫苗RA27/3株中RV RNA，严格按试剂盒说明书操作。0.5 ml反应管中逆转录反应体系总体积为20 μl，包含 4.0 μl RT buffer (5×)，1.0 μl AMV RTase(5 U/μl)×L，4.0 μl dNTPs (2.5 mM)，0.5 μl RNase inhibitor (40 U/μl)，1.0 μl Random 9 Primer (50 pmol/μl)，5.0 μl RV RNA 模板，4.5 μl DEPC 双蒸水。将混合物振荡混匀，离心30 s，于PCR仪里按下列条件反应运行，30℃10 min，42℃60 min，99℃5 min，5℃ 5 min，合成RV cDNA。

1.2.2RV基因特异性PCR扩增子作为参考标准品 根据RV RA27/3基因序列(GeneBank no. X14871.1)，引物设计、反应体系及反应条件参照文献[2]。上游引物：5′-ATGCGTCCGCTTTGAGTC -3′，下游引物：5′-TATGTCCGTGCGGCGTGTTAG-3′，引物序列由上海博亚有限公司合成；以合成的RV RA27/3 cDNA为模板按下列反应体系和条件扩增目的片断；50 μl反应体系中：上下游引物各1.0 μl(25 μM)，Ex-Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl， 10×LA PCR Buffer II (Mg2+Free) 5 μl，MgCl2(25 mM) 5 μl， 四种dNTP混合物8 μl(各2.5 mM)，pBluscriptII SK-E1 DNA模板10 μl，三蒸水19.5 μl；反应条件：93°C 4 min 预变性， 93°C 变性45 s，55°C退火1 min，72°C延伸3 min，共35个循环；最后72°C延伸5 min。然后,将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察，切取相应的条带纯化回收。

1.2.3RV基因特异性PCR扩增子标准品的定量及纯度测定 取10 μl纯化的PCR RV cDNA 样品稀释到500 μl，采用紫外分光光度计法测定OD260nm，换算成样品的拷贝浓度，重复三次取平均值，以确定该标准品的浓度；测定OD260nm/OD280nm分析其纯度。将确定浓度及纯度的RV PCR扩增子标准品，进行一系列整倍数稀释，-70℃保存，用作后继研究中RV实时荧光定量RT-PCR定量标准品。

1.3RV 实时荧光定量RT-PCR 上、下游引物采用上述制备RV基因特异性PCR扩增子标准品的引物，TaqMan 探针设计，反应体系及反应条件参照文献[2]，TaqMan 探针序列：5′-GATTGTGGACGGCGGCT-3′，由上海博亚有限公司合成。优化的50μl PCR 反应体系中，包含10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)缓冲液5 μl，上下游引物各1.0 μl(25 μM)，TaqMan荧光探针1.0 μl(25 μM)，Ex-Taq 聚合酶(5 U/μl ) 0.5 μl，MgCl2(25 mM) 5 μl，4 种dNTP 混合物8 μl(各2.5 mM)，样本cDNA、107～102不同梯度稀释的标准品cDNA模板、阴性对照(三蒸水)及阴性对照DNA(质粒pET30a(+))各10 μl。优化的反应条件：94℃预变性2 min，然后94℃变性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸30 s，先做10个循环，最后94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，做30个循环。于PE7300全自动PCR扩增分析仪上进行 PCR 扩增。

1.4统计学方法 直线回归与相关应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。

2 结 果

2.1定量阳性标准品制备及定量 RV基因特异性PCR扩增子标准品为RVE1高度保守区一段503 bp的序列(图1)。紫外分光光度计法定量该特异性PCR RV cDNA标准品，测OD260nm，OD值为0.014，然后算出该RV cDNA的质量浓度为2.75×109拷贝/μl。OD260nm/OD280nm为1.95，示该定量标准品具有92%的纯度。

图1 RV基因特异性PCR扩增产物凝胶电泳M: Marker DL2000，1. 阴性对照，2. RV基因片断PCR 结果(503 bp)

2.2定量阳性标准动力学曲线、标准回归曲线的建立及回归方程的设定 10倍系列稀释的标准品cDNA(2.75×107～2.75×102拷贝/反应)在PE7300全自动实时荧光定量PCR仪上扩增后，系统根据荧光值的变化规律，自动生成标准动力学曲线。系统根据荧光值的变化规律，通过baseline 的设定，自动生成标准回归曲线。标准曲线是以循环阈值(Cycle threshold，Ct)为纵坐标，以阳性标准模板基因拷贝数的自然对数为横坐标的一条严格的直线型曲线，由标准回归曲线可以看出,该标准品不同稀释度的各个有效反应点均落在标准曲线的相应位置上,线性相关系数r为-0.9993(r2=0.9986)，P<0.001，表明10倍系列稀释的不同浓度的标准品cDNA的自然对数值与相应的Ct值具有良好的相关性，证实了本研究建立的风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。系统运行Analysis 过程,生成回归方程为:y =-3.15x +31.29。

3 讨 论

风疹是由风疹病毒引起的一种全球性传染病，人群对风疹病毒普遍易感，给人类健康带来极大危害。育龄妇女特别是孕妇早期感染常常具有危及胎儿导致胎儿致畸或死胎以及引起自然流产的危险。为提高出生人口质量，降低异常妊娠的发生率及自然流产次数，采用简便、快速、准确、定量的实验室诊断方法具有十分重要的意义。

目前检测风疹常用ELISA法测定患者血清中的特异性风疹IgM抗体，该方法快速、灵敏，但是至少发病后5天才可以检测到，并且容易引起假阳性反应[3]；细胞培养病毒分离法，用于临床标本中风疹病毒检测十分准确，但操作复杂、步骤繁琐，需要的检测时间长；传统PCR方法虽简便快捷，但存在不能定量，易交叉污染等缺点。近年出现的实时荧光定量PCR技术，融汇了PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性以及光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，弥补了常规PCR易产生假阳性和不能定量两大技术缺陷，避免了交叉污染，使其成为基础研究和分子生物学诊断领域最热门的技术之一[4]。

本研究建立了一种风疹病毒RNA Taqman实时荧光定量RT-PCR方法，并采用传统PCR制备了与目的片段一样的定量阳性参考标准品，可以保证目的片段与标准品的扩增效率一致[5]。采用本研究制备的标准品建立的标准回归曲线(图3)，线性相关系数r为-0.9993(r2=0.9986)，P<0.001，示不同稀释度的标准品的自然对数值与相应的Ct值具有良好的相关性，证实了本研究建立的风疹病毒RNA Taqman实时荧光定量RT-PCR方法定量的高准确性。因此建立的风疹病毒RNA Taqman实时荧光定量RT-PCR方法具有简便、快速、准确、定量的特性，将其运用于RV感染的早期临床诊断，可为临床风疹诊断与治疗提供及时准确的依据，最大限度地降低育龄妇女风疹病毒感染率，最大限度地减少死胎、畸胎等的发生率，使优生优育工作更上一个台阶，进而提高全社会出生人口的素质。

致谢：本研究得到了中山医科大学达安基因公司的大力协助，在此表示衷心的感谢！

[1] Edlich RF, Winters KL, Long WB 3rd, et al. Rubella and congenital rubella( German measles)[J].J Long Term Eff Med Implants, 2005, 15(3): 319-328.

[2] LH Zhao, YY Ma, H Wang, et al. Establishment and Application of a TaqMan Real-time Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Rubella Virus RNA[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2006,38(10):731-736.

[3] Graham A Tipplesa, Rasool Hamkarb, Talat Mohktari-Azadb, et al. Evaluation of rubella IgM enzyme immunoassays[J]. Journal of Clinical Virology,2004,30(3): 233-238.

[4] Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations[J].TRENDS in Molecular Medicine, 2002,8(6):257-260.

[5] 罗勇军,刘昕.实时荧光定量PCR 标准品的制备及应用[J].重庆医学,2005,34(3): 414-415.