荧光原位杂交技术在检测宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的应用进展

宋英君 王 霞 赵爱琳

(青岛市立医院妇科； 山东 青岛 266000)

荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization， FISH)是分子细胞遗传学技术的一项重要内容[1],近十几年来已从基础医学研究广泛地转向临床医学检测领域。本文就荧光原位杂交技术(FISH)检测子宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的临床应用做简要综述。

1 背 景

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，严重地危害妇女身体健康。 根据我国有关权威部门最新流行病学调查，子宫颈癌及癌前病变的患病率高达万分之六十七，因此，进行早期的筛查和诊断尤为必要。

早期诊断是治疗宫颈癌及提高患者预后的有效手段。国际上通用的筛查宫颈癌的方法一般为宫颈细胞涂片形态检查及HPV病毒检测。细胞涂片检查敏感性一般在55%～80%左右，但一旦观察到异常特异性可达到90%以上。但在分级鉴别中人为的因素大，客观性和准确性不够。HPV 检测虽敏感性高，在84%～100%之间，但特异性一般只在64%～95%之间，并且90%的HPV阳性的病人在两年之内可转阴，并不会导致宫颈癌的发生。因而从宫颈癌筛查及早期诊断角度出发，迫切需要其他可靠指标或手段来协助以上检查，使结果更准确、可靠及更有预见性。

最近几年，针对宫颈癌的研究表明，宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增，其中涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶(hTERC)基因[2-3]，扩增可阻止细胞的凋亡，因而可导致肿瘤的发生。因此，对hTERC基因扩增的检测有助于宫颈癌的筛查及早期诊断[4-9]，FISH技术为检测这一基因扩增的标准方法。

2 原 理

荧光原位杂交 (fluorescent in situ hybridization FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸杂交原理在细胞核中或染色体上显示 DNA 序列位置的方法。FISH采用荧光标记的DNA探针，根据探针与被检测标本中DNA序列的互补性，探针与样本DNA杂交后，在荧光显微镜下检测荧光信号而得出结果。FISH技术本身操作相对简单，重复性好、稳定，并具有很高的灵敏性及特异性。因此FISH非常适用于临床医学检测。

2.1 FISH 技术的探针类型

FISH 技术是将标记的探针和待测序列杂交，根据杂交信号的有无及类型，达到诊断染色体病的目的[10-11]。 探针的种类按核酸性质不同又可分为 DNA、cDNA、cRNA 及合成寡核苷酸探针。用于杂交的探针包括5类：①染色体计数探针。主要指来自染色体着丝粒部位的特殊序列，如α卫星 DNA 或染色体的特异片段 Y 染色体长臂的异染质区。②染色体位点特异探针。指针对某一染色体上单一 DNA 序列的探针， 例如诊断 Y 染色体性别决定区( sex determination region of Y chromosome，SRY) 基因的探针，可用来诊断染色体有无缺失、重复或诊断染色体微缺失综合征。③全染色体涂抹探针(whole chromosome painting probes，WCP)这类探针特异地覆盖特定的靶染色体，可用来诊断染色体的结构异常，如缺失、插入、易位等。④专门研究端粒的探针。其与着丝粒探针 WCP 联合也用于检测染色体易位等。⑤为特异患者制作特殊探针成功跨越断裂点全长的探针，可用于筛查染色体臂间倒位及易位等。

2.2 FISH 技术的探针荧光标记方法

FISH 技术的探针荧光标记方法分为直接法及间接法。直接法用荧光素直接标记特殊的探针，经变性、杂交、漂洗后，可直接在荧光显微镜下检测染色体结构。 间接法则在杂交、漂洗之后，依抗原抗体反应的原理，既将荧光素与探针结合，又将荧光素与其特异的抗体结合，将待测信号放大，从而得以检测特异的靶序列。间接法放大作用强，对单一序列诊断的敏感性较高。目前从单色 FISH 发展到双色 FISH乃至多色 FISH，已经可以用不同的荧光素以不同比例混合得到多种颜色的探针，诊断人类的多条染色体有无变异。

3 应 用

人类染色体端粒酶 RNA (hTERC)由 Feng等[12]于1995年首次从肾癌 293细胞系 cDNA文库中筛选出。hTERC是合成端粒重复序列的模板,是端粒酶活性必需的核心组分之一。近年来研究显示,宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变过程中,几乎均伴有3号染色体长臂扩增,其中所涉及最重要的基因可能为 hTERC基因。

Nakano[13]应用原位杂交法检测宫颈不典型增生/化生、原位癌及浸润癌等高增殖活性组织中 hTERC基因,发现均伴有 hTERC原位杂交信号局灶性高表达,提示 hTERC表达上调可能促使端粒酶激活,与宫颈癌发生发展有关。Wisman等[14]应用原位杂交及逆转录 —聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测宫颈上皮内瘤变 (CIN) Ⅰ～Ⅲ级、宫颈癌和正常宫颈组织标本中 hTERC表达,结果几乎所有标本都检测出hTERC表达,未证明 hTERC与宫颈病变的关系。2003年,Heselmeyer等[15]首次将荧光原位杂交 (FISH)技术成功应用于宫颈细胞涂片检测 3q26 hTERC基因。研究发现,只有极少数正常、不典型增生 (ASC)和轻度上皮内病变 (LSIL)标本检测到 hTERC扩增,而 CIN Ⅱ中 hTERC扩增者占 63%,CINⅢ中占 76%,四倍体细胞数和 hTERC表达水平随病变严重程度增加,认为 hTERC检测可作为筛查高度上皮内病变(HSIL)的独立指标,有助于预测宫颈病变进展情况。2年后 ,Heselmeyer等[16]再次应用 FISH技术检测 hTERC基因,标本取自随访 1～3 年中进展至 CINⅢ的 CINⅠ/CINⅡ者 (进展者 )、自愈的 CINⅠ/CINⅡ患者 (自愈者 )。结果发现,所有进展者都伴有hTERC扩增,而自愈者无1例。值得注意的是,有 33%细胞学正常的标本检测到 hTERC扩增,而这些患者历经短暂的潜伏期后被确诊为 CINⅢ或浸润癌。提示hTERC检测可早期诊断宫颈癌,预测病变进展。FISH检测可降低细胞学的假阴性率。

高危型 HPV感染已公认是宫颈癌发病的首要因素,Hopman等[17]研究了宫颈病变中, hTERC表达及 HPV整合情况的关系。其将 FISH探针应用于 CINⅡ/Ⅲ、微浸润癌及浸润癌标本,检测 HPV病毒的物理状态和 hTERC拷贝数。结果显示,随病变进展, hTERC拷贝数逐渐增加,而 hTERC扩增标本中,HPV也大部分被整合。从而认为宫颈 HPV感染与 hTERC扩增有关,高危型 HPV的基因整合和 hTERC扩增可能是宫颈 ASC向浸润癌发展的重要因素 ,但尚未得出HPV感染导致 hTERC表达上调,从而使癌发生的结论。 Andersson等[18]也报道h TERC 基因在子宫颈腺癌的扩增比例范围为2.3～5.2， 平均比例为 3.3，hTERC 基因的检测有助于子宫颈癌的早期筛查及诊断。

4 展 望

目前的研究已初步提示, hTERC基因在宫颈癌发生、发展中发挥了一定作用,但其具体机制尚不明确。hTERC对端粒酶活性至关重要,而端粒酶活性与宫颈癌发生密切相关,对抗 hTERC抑制端粒酶活性，有望成为宫颈癌治疗的新手段。在宫颈癌潜伏期即可检测到hTERC扩增,因而 hTERC检测可用于宫颈癌早期诊断,且 hTERC扩增水平与肿瘤恶性程度呈正相关,可用于预测病情进展,并为选择治疗方法提供依据,应用 FISH法对 hTERC进行定性、定量分析将具有重要意义。

[1] Levsky JM, Singer RH. Fluorescence in situ hybridization:past , present and future[J].J Cell Sci, 2003, 116: 2833 -2838.

[2] Munger K, Baldwin A, Edwards KM, et al. Mechanisms of human papilloma virus - induced oncogenesis[J].JVirol,2004, 78: 11451 - 11460.

[3] Sugita M, Tanaka N, Davidson S, et al. Molecular definition of a small amplification domain within 3q26 in tumors of cervix , ovary , and lung[J].Cancer Gen Cytogenet, 2000,117: 9 - 18.

[4] Heselmeyer K, Schrock E, Du Manoir S, et al. Gain of chromosome 3q defines the transitionfrom severe dysplasia toinvasive carcinoma of the uterine cervix[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 479 - 484.

[5] Heselmeyer K, Macville M, Schrk E, et al. Advanced -stage cervical carcinomas are defined by a recurrent pattern of chromosomal aberrations revealing high geneticinstability and a consistent gain of chromosome arm 3q[J].Genes Chromosomes Cancer, 1997, 19: 233 - 240.

[6] Kirchhoff M, Rose H, Petersen BL, et al. Comparative genomic hybridization reveals a recurrent pattern of chromosomal aberrations in severe dysplasia/carcinoma in sute of the cervix and in advanced - stage cervical carcinoma[J].Genes Chromosomes Cancer, 1999, 24: 144 - 150.

[7] Allen DG, White DJ, Hutchins AM, et al. Progressive ge-netic aberration detected by comparative genomic hybridiza-tion in squamous cell cervical cancer[J].Br J Cancer, 2000,83: 1659 - 1663.

[8] Yang YG, Shyong WY, Chang MS, et al. Frequent gain of copy number on the long arm of chromosome 3 in human cer-vical adenocarcinoma[J].Cancer Genet Cytogenet, 2001, 131:48 - 53.

[9] Huang FY, Kwok YKY, Lau ET, et al. Genetic abnor-malities and HPV status in cervical and vulvar squamous cell carcinomas[J].Cancer Genet Cytogenet, 2005, 157: 42 - 48.

[10] Sermon K, Van Steirteghem A, Liebaers I. Preimplantation genetic diagnosis[J].Lancet,2004,363 (9421):1633-1641.

[11] Nelson LJ. Preimplantation diagnosis[J].Clin Perinatol, 2003, 30(1) :67-80.

[12] FengJ, FunkWD,Wang SS, et al. TheRNA componentof human te-lomezase[J].Science,1995,269(5228):1236-1241.

[13] Nakano F. Malities and HPV status in cervical and vulvar squamous cell carcinomas[J].Cancer Genet Cytogenet, 2005, 157: 42 - 48.

[14] Wisman GB,De Jong S,Meersma GJ, et al. Telomerase in (pre) neoplasticcervicaldisease[J].HumPathol,2000,31(10):1304-1312.

[15] HeselmeyerHK,Janz V,Castle PE, et al,Detection of genomic amplification of the human telomerase gene (TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the diagnosisof cervical dysplasia[J].AmJ Pathol,2003,163(4):1405-1416.

[16] HeselmeyerHK, Sommerfeld K,White NM, et al. Genomic amplification of the human telomerase geng (TERC) in pap smears predictsthe developmentof cervical cancer[J].Am J Pathol,2005,166(4):1229-1238.

[17] Hopman AH, TheelenW,Hommelberg PP, et al. Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cer vical dysplasia to invasive cancer[J].J Pathol,2006,210(4): 412-419.

[18] Andersson S,Wallin KL, Hellstrem AC, et al. Frequent gain of thehuman telomerase gene TERC at 3q26 in cervical adenocarcinomas[J]. BrJ Cancer,2006,95(3):331-338