D型钠尿肽对豚鼠胃窦环形肌细胞钙敏感钾电流的影响及其作用机制*

张曙影，李 萍，闻庆平，曲成龙，蔡正旭，郭慧淑

(1.大连医科大学 附属第一医院 中心实验室，辽宁 大连 116011; 2.大连大学 附属中山医院 心内科，辽宁 大连116001)

钠尿肽是具有生物活性的多聚肽类家族，它包括ANP、BNP、CNP和DNP。这些肽类分布在全身各处发挥其生理功能，如尿液的排出、血管扩张、调节血压和电解质平衡等[1]。D型钠尿肽(dendroaspis natriuretic peptide,DNP)是最近新发现钠尿肽家族的成员，是从一种美洲蛇的蛇毒中提炼出来的由38个氨基酸组成聚肽类物质。到目前为止，关于DNP的研究仅仅局限在心血管系统、泌尿系统和生殖系统。DNP对胃肠动力方面的研究非常少。Kim JH等[2]首次在大鼠的结肠内发现DNP并发现它通过局部的调质调节结肠动力。作者前期研究发现钠尿肽能调节胃肠动力,而且DNP通过cGMP途径抑制胃动力[3,4]，但其深入的离子通道机制还不清楚。NP系统类似与NO系统都是产生cGMP的系统，作者以往的研究中发现SNP可以通过IP3受体介导的钙库钙释放产生cGMP而达到抑制胃肠动力的作用[5]。因此，本研究考虑到DNP调节胃肠动力可能与IP3受体有关。基于以上的背景,本研究深入探讨DNP对胃窦环形肌细胞上钙敏感钾电流[IK(Ca)]的影响，并探讨cGMP途径和细胞内钙库在其中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞制备

用25%的氨基甲酸乙酯(50 mg/kg)麻醉动物后，迅速剪取胃窦部放入氧饱和的无钙的PSS缓冲液中漂洗，然后分离环行肌并将其分割成几个肌条(1 mm×4 mm)。将肌条放入4℃的K-B液中保存约15 min，之后将其放入装有36℃消化液的试管中进行孵育。消化液是由0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.1%的二硫苏醇糖、0.15%的胰蛋白抑制剂和0.2%的牛血清白蛋白溶入4 mL无钙的PSS缓冲液组成的。孵育结束，将消化好的肌条移入4℃K-B液中保存。

1.2 药品和溶液

台氏液成分(mmol/L)：NaCl 147,KCl 4,MgCl2·6H2O 1.05,CaCl2·2H2O 0.42,Na2PO4·2H2O 1.81,Glucose 5.5，以NaOH调pH值至7.35；PSS成分(mmol/L)：NaCl 134.8,KCl 4.5,MgCl2·6H2O 1.0,CaCl2·2H2O 2.0,Glucose 5.0,HEPES 10.0,以Tris调pH值至7.40；无钙PSS的成分(mmol/L)：NaCl 134.8,KCl 4.5,HEPES 10,MgCl21,Glucose 10,以Tris调pH值至7.40；Kraft-Bruhe液(K-B液)的成分(mmol/L)：EGTA 0.5,HEPES 10,MgCl23,KCl 50,Glucose 10,L-Glutamate 50,Taurine 20,KH2PO4 20,以KOH调pH值至7.40；记录IK(ca)电极内液的成分(mmol/L)：K-aspartic acid 110,Mg-ATP 5,MgCl2·6H2O 1.0,KCl 20,EGTA 0.1,di-tris-creatine phosphate 2.5,disodium-creatine phosphate 2.5,HEPES 5,以KOH调pH值至7.30；配制完成后，用1 mL的分装瓶分装存放于0℃的冷冻箱中，实验前解冻使用。

非选择钾通道阻断剂(Tetraethylammonium TEA)配成10 mmol/L，DNP配成0.1、1、10、100 nmmol/L不同浓度。乌苷酸环化酶抑制剂(LY83583)和CGMP敏感磷酸酯酶抑制剂(Zaparinast)各配成相应的浓度。实验中用到的所有药品均为美国Sigma公司产品。

1.3 电生理记录

在实验前用管口圆滑的滴管轻轻吹打肌条即可得到分离的单细胞。取1滴细胞悬浮液(0.1 mL)平铺于倒置显微镜(Ⅸ-70 Olympus,Japan)镜台上的灌流槽底部，待10～15 min细胞沉降至槽底后，用等渗溶液进行灌流(2～3 mL/min)。然后用电阻为2～5 MΩ的玻璃电极进行5～10 GΩ的千兆封接。用传统全细胞模式记录膜电流，在电压钳制在-60 mV，阶跃电压刺激从-40 mV开始，以每20 mV的阶跃幅度去极花至+100 mV，持续400 ms记录钙敏感钾电流。用相同电极内液，电压牵制在-200 V连续记录自发瞬间外向钾电流(spontaneous translent outwad ourrents's ToCs)。

1.4 统计学方法

实验数据用均数±标准误来表示。用同体对照的t检验，P<0.05为差异具有显著性意义。

2 结 果

2.1 豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流和自发瞬间外向钾电流的记录

SToCs与IK(ca)同样是钙敏感钾电流，前者是睡间外向钾电流[6]，可以连续记录。用非选择性钾通道阻断剂TEA和特异性钙敏感钾通道阻断剂CHTX检测Stocs从而确定记录到的是否是IK(Ca)，见图1。

图1非选择性钾通道阻断剂TEA和特异性钙敏感钾通道阻断剂CHTX对豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流的影响

2.2 DNP对豚鼠胃窦环形肌细胞IK(ca)的影响

DNP明显增加IK(Ca)，并具有剂量依赖关系，0.1、1、10和100 nmol/L的DNP增加IK(Ca)的幅度分别为(16.7±1.12)%、(26.5±2.3)%、(46.2±3.3)%和(58.3±3.7)%。10 nmol/L的DNP明显增加STOCs的幅度和频率，见图2。

图2不同浓度的DNP增加豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流的剂量依赖关系，与上一个浓度组相比，a：P<0.01

2.3 细胞外钙对DNP增加IK(Ca) 的影响

IK(Ca)的激活与细胞外钙的内流有密切关系。为探讨细胞外钙是否参与DNP增加IK(Ca)过程，将细胞外液换成无钙液后观察10 nmol/L的DNP对IK(Ca)作用，结果发现DNP仍然增加IK(Ca)，其增加幅度为(47.1±2.7)%(图3)。由于L型钙通道是细胞外钙离子内流的主要通道，因此，作者用L型钙通道阻断剂尼卡地平后发现尼卡地平明显抑制IK(Ca),但不影响DNP对IK(Ca)的增加作用。见图4。

图3细胞外钙无钙对DNP增加豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流的影响，与对照组相比，a：P<0.05，b：P<0.01

图4 L型钙通道阻断剂对DNP增加豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流的影响，与PSS组或nicardipine组比较，

a：P<0.01

2.4 细胞内钙库钙释放与DNP增加IK(Ca)之间的关系

钙敏感钾通道能被细胞内IP3受体介导的钙库和Rydonine受体介导的钙库释放的钙所激活。因此，本文观察了细胞内这两大钙库是否参与DNP增加IK(Ca)和STOCs的过程。结果发现，IP3受体阻断剂肝素明显抑制DNP增加IK(Ca)和STOCs(图5)，而Rynodine是Rynodine受体介导钙库的钙的耗竭剂，用Rynodine后STOCs先短暂增加，这是Rynodine受体介导钙库钙耗竭过程，耗竭完毕后给予其钙库的激动剂Cafeine后发现STOCs不再增加。此时再给予DNP，发现DNP仍然可以增加STOCs，见图6。

图5 IP3受体阻断剂肝素对DNP增加STOCs的影响。与对照组，c：P<0.01

图6 Rynodine受体介导的钙库与DNP增加STOCs之间关系，与对照组相比，d：P<0.01

2.5 cGMP对DNP引起STOCs 的作用

为了进一步探讨cGMP在DNP增加STOCs过程中的作用，从cGMP生成减少和降解减少两方面证实了cGMP确实参与DNP对豚鼠胃窦环行肌STOCs的增加过程。鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583明显抑制DNP对STOCs的增加作用(图7)，而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂却增强其作用(图8)。

3 讨 论

本实验发现在豚鼠胃窦环形肌上DNP增加IK(Ca)和STOCs，细胞外换成无钙液或尼卡地平均不能抑制DNP引起的IK(Ca)的增加。肝素明显抑制DNP引起的STOCs的增加而Rynodine无此效应。另外，鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583抑制DNP引起的STOCs的增加而cGMP敏感磷酸酯酶抑制剂Zaparinast却增强DNP引起的STOCs的增加。

在平滑肌上主要有三种钙敏感钾通道：大电导和中等电导的钾通道可以被2 mmol/L的TEA和200 nmol/L的CHTX阻断而小电导的钾通道不能被5 mmol/L的TEA阻断而对apamin敏感。本研究发现钙敏感钾通道可被4 mmol/L TEA和200 mmol/L CHTX阻断，因此是大电导钾通道。给予去极化刺激时平滑肌上可记录到三种钾通道：钙敏感钾通道[IK(Ca)]、延迟整流型钾通道[IK(V)]和瞬间外向钾通道I(TO)[7]。以往研究表明在豚鼠胃窦环形肌上只能记录到两种钾通道即IK(Ca)和IK(V)[8]。为了去掉IK(V)成分，采用了3种方法：①电极内液中中加入0.1 mmol/L的EGTA;②细胞外液中加入10 mmol/L的4-AP;③TEA和CHTX明显阻断STOCs(图1A、B)。钙敏感钾通道与平滑肌的收缩有密切关系。以往的研究表明，NP能通过激活IK(Ca)舒张平滑肌。ANP可以通过激活IK(Ca)舒张人呼吸道平滑肌，在此过程中cGMP系统参与此过程。CNP通过激活大电导的IK(Ca)引起犬类股静脉血管平滑肌的舒张，cGMP系统参与此过程。BNP通过激活IK(Ca)和启动NO产生而实现动脉血管平滑肌的舒张。但到目前为止，没有关于IK(Ca)与胃肠动力之间关系的报道。以往作者的研究中发现DNP抑制豚鼠胃窦环形肌自发性收缩活动而在本研究中又发现DNP明显增加IK(Ca)和STOCs并呈现剂量依赖关系(图2)。

图7鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583对DNP增加STOCs的影响，与对照组相比，e：P<0.05;与DNP组相比，f：P<0.01

图8 cGMP敏感磷酸酯酶抑制剂Zaparinast对DNP增加STOCs的影响。与对照组相比，g:P<0.01

IK(Ca)受到细胞内外钙离子的调节。为证明这些钙动员与DNP增加IK(Ca)之间的关系，本研究发现，在细胞外缺乏钙离子的情况下观察DNP的作用(图3、4)。结果显示DNP在细胞外缺乏钙离子时仍然增加IK(Ca)。另外，L型钙通道阻断剂尼卡地平能抑制钙电流但不能抑制DNP引起的IK(Ca)的增加。这表明细胞外的钙离子不参与DNP增加IK(Ca)的过程。

平滑肌细胞内钙库主要有两种：IP3受体介导的钙库和Rynodine受体介导的钙库。研究表明，SNP可通过启动IP3受体介导的钙库的钙释放增加IK(Ca)引起动脉血管平滑肌的舒张[9]。研究表明，在心血管系统牵张刺激引起的BNP基因的表达需ynodine受体介导的钙库钙释放，从而使神经钙蛋白和神经钙蛋白依赖的激酶激活而实现。这些研究都表明平滑肌舒张和细胞内钙库释放钙之间有密切的关系。与本研究结果一致：DNP通过激活细胞内IP3受体介导的钙库的钙释放激活IK(Ca)(图5、6)。

DNP实现很多生理功能是通过激活cGMP途径。研究报道DNP通过启动cGMP系统舒张人动脉和静脉平滑肌。DNP也可通过cGMP产生引起H9C2细胞凋亡。本研究中发现鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583抑制cGMP产生削弱DNP引起的STOCs的增加(图7)，而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂使cGMP降解减弱而使细胞内cGMP浓度增加从而使DNP增加IK(Ca)的程度加强(图8)。这些数据显示，DNP通过激活IP3受体介导的钙释放和增加cGMP产生引起IK(Ca)增加，从而引起豚鼠胃窦环形肌舒张。

DNP通过细胞内cGMP的产生和IP3受体介导钙库的钙释放，使豚鼠胃窦环形肌细胞上钙敏感钾电流增加，进而使细胞超极化使平滑肌舒张。

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