超声时间与药材粒度对超声法提取槐花米中芦丁的影响*

张宝璟，张广元，甄宇红，于振龙，黄珊珊，马骁驰，刁云鹏，舒晓宏

(1.大连医科大学 药物化学教研室，辽宁 大连 116044； 2.大连医科大学 药学院 2007级学生，辽宁 大连 116044)

芦丁 (Rutin)，又名芸香苷 (5,7,3′,4′,-四羟基-3-芸香糖黄酮)，为广泛存在于多种药用植物及食物中的黄酮类化合物，其中以槐花米中含量为高，产率一般可达10%以上。芦丁及其衍生物具有降血压、降血脂、抗过敏及抗炎等多种生理活性[1,2]，在临床上应用广泛。目前，实验室对芦丁的提取方法通常采用的有碱提取酸沉淀法、连续回流提取法、乙醇浸渍法、渗漉法等。其中，以碱提酸沉法使用最多[3]。

近年来超声提取技术在天然产物提取方面得到广泛应用，超声波通过溶液介质引起的空化作用，能够加速药材中有效成分的溶出，从而提高药物有效成分的提取效率，成为一种天然药物有效成分提取的新方法[4]。关于超声法从槐花米中提取芦丁虽有报道[5]，但对于超声操作方法阐述不一。鉴于此，本研究在传统碱提酸沉法[3]基础上，将槐花米粉碎至不同的粒度及超声提取不同的时间，观察药材粉碎度及超声时间对芦丁提取效率的影响。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

RT-08高速粉碎机，北京环亚天元机械技术有限公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；pHS-3C型酸度计，上海雷磁仪器厂；FA1004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配有Waters 1525二元泵及2487双波长紫外检测器；Inertsil ODS-3 C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，日本岛津公司。

槐花米，购自大连美罗大药房；芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所(批号：0080-9705)；甲醇 (色谱纯，Fisher Sci, USA)；磷酸、乙醇、浓盐酸、氧化钙及硼砂均为分析纯，购自天津市博迪化工有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 槐花米细粉制备：称取槐花米药材，干燥后用粉碎机粉碎，收集经过分别经过1号筛、3号筛及5号筛的粉末，连同槐花米粗粉(未通过1号筛)各称取20 g 进行超声提取。

1.2.2 超声辅助提取法：将槐花米粉末，每份20 g，加入蒸馏水300 mL，再加入硼砂1 g，石灰乳调至pH 9[3]，分别超声(150 W、40 KHz、70℃)2、5、10、20、30、60 min，抽滤[4]。回收抽滤所得残渣，重复以上操作1次。合并滤液，在室温下用浓HCl调至pH3[3]，放置过夜。抽滤后得芦丁粗品，置恒温干燥箱中干燥，称重。然后用蒸馏水按1g∶200 mL的比例进行重结晶，放置过夜，滤取沉淀并干燥称重，计算芦丁产率。

1.2.3 芦丁的鉴定：取芦丁样品及标准品各3～4 mg，加乙醇5～6 mL，使其溶解，进行Mg-HCl及锆盐/枸橼酸的颜色检测；芦丁的样品及其标准品甲醇溶液，滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱条件如下：色谱柱为Intersil ODS-3(4.6×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶0.3 %磷酸(35∶65)，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温35℃，进样量10 μL[3]。

2 结 果

2.1 药材粉碎粒度及超声时间对芦丁产率的影响

粉碎至不同粒度的槐花米粉末，超声所得芦丁产率在一定时间范围内均与超声时间正相关，而后呈平台趋势(图1)，但随着超声时间延长，过滤困难，操作时间明显延长(图1)。粉碎粒度不同，提取产率也不同，颗粒越小，提取效果越好(图2)。5号筛粉末提取效率最高，但过滤困难，操作总时间延长，故但当粒度<3号筛后，提取率没有明显提高。综上因素，在本实验条件下，采用过3号筛的粉末超声5 min即达到较高的提取产率(16.46%)，从而大大地缩短了反应时间。

图1 槐花米粉碎粒度及超声时间对芦丁产率的影响

*代表粉碎至不同粒度的槐米粉末达到较高提取产率所需时间(粗研粉末：30 min; 1号筛粉末：20 min; 3号筛粉末：5 min； 5号筛粉末：5 min)

图2超声时间为5 min时间点不同粉碎粒度槐米的芦丁产率

*3号筛产率为 (16.46±2.0)%；5号筛粉末产率为 (16.79±2.1)%

2.2 样品的鉴定

样品甲醇溶液加入盐酸-镁粉后溶液呈红色；样品甲醇溶液加入锆盐后显黄色，再加入枸橼酸后黄色褪去。上述反应与芦丁标准品一致。

提纯的芦丁样品经HPLC分析，在tR= 9.132 min处出现单一色谱峰(图3A)，紫外图谱显示该峰在256 nm 与357 nm 附近有最大吸收(图3 B)，该图谱与芦丁标准品的保留时间及紫外吸收基本一致(图3C、3D)，故所提样品为芦丁。

图3 芦丁样品及标准品的HPLC、UV光谱A 芦丁样品的HPLC (tR=9.117 min)；B 芦丁样品UV光谱 (λmax=256 nm; 357 nm)C 芦丁标准品的HPLC (tR=9.132 min)； D 芦丁标准品UV光谱 (λmax=257 nm; 358 nm)

3 讨 论

超声波提取技术在中药有效成分提取中的应用日趋广泛，其通过液体介质引起的空化作用可造成植物细胞壁的瞬间破裂，便于提取溶剂渗透到植物细胞中，从而加速药材中有效成分的溶出，并且超声波提取不会改变有效成分的结构，同时减少溶媒用量、提高了提取效率，因而成为一种植物有效成分提取的新方法[5]。

在以往的实验操作如煎煮法、浸渍法中，药物一般不宜细粉，但超声法中因超声波是一种弹性机械振动波，通过介质作用局部可产生巨大压力和千度高温，从而适于微粉化原料药的提取，促进植物细胞破壁，使细胞内的有效成分充分暴露出来，迅速、完全地释放到适宜溶剂中，因而提高提取效率。

本实验将槐花米粉碎至不同粒度，较短时间超声下，芦丁产率随粒度减小而升高，但粉末<3号筛后，过滤明显困难，操作时间延长，可能由于粉末过细阻塞滤纸所致。同时，相同粒度粉末超声所得芦丁产率在一定时间范围内与超声时间正相关，到达一定时间点后，芦丁粗品产率虽有提高，但精制芦丁产率却略有下降，并且过滤困难，其原因可能是随着超声时间延长，杂质含量增加，而芦丁在高频率偏碱性的条件下也可能发生一定程度地降解。与一般文献报道采用乙醇为提取溶剂的超声法[6]比较，本研究采用碱液对微粉的槐花米进行超声提取能够明显缩短反应时间，并显著提高提取效率。虽然，超声法提取的产率较以前传统酸碱法的产率稍低[3]，但能够大大地缩短反应时间，从而明显地提高了芦丁提取效率。因此，药材微粉化与超声法结合将为天然药物中有效成分的提取提供一种新的思路。

[1] 臧志和，曹丽萍，钟铃. 芦丁药理作用及制剂的研究进展[J]. 医药导报，2007,126(17):758-760.

[2] Chen KC, Hsieh CL, Huang KD, et al. Anticancer activity of rhamnoallosan against DU-145 cells is kinetically complementary to coexisting Polyphenolics in Psidium guajava budding leaves [J]. J Agric Food Chem，2009,57(14):6114-6122.

[3] 舒晓宏，冯梅，陈华，等．槐花米中芦丁提取最佳pH值的实验研究[J]．大连医科大学学报，2005,27(2):91-92．

[4] 马国刚，王建中，卢晓蕊. 响应面分析法优化槐米芦丁超声波提取工艺的研究[J]．食品与发酵工业，2007,33(8):167-172.

[5] 吴立军. 天然药物化学[M]. 第5版.北京：人民卫生出版社，2007.19.

[6] 郭玉，唐国涛，陈淑娴，等.槐花米中芦丁提取方法的比较研究[J]．中成药，2007，29(11):1675-1677.