关节腔内注射生长抑素治疗兔膝关节骨性关节炎的实验研究*

李 健，谢振钧，孟 鑫，陈广滨，陈 鹏，王惠亭

(大连大学 附属新华医院 骨科，辽宁 大连 116021)

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是50岁以上人群肢体功能残疾造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一，临床表现为关节疼痛、变形和活动受限，且伴有不同程度的滑膜炎症。炎症又可导致关节结构破坏，促进骨性关节炎病情的进展。本实验采用生长抑素关节内注射，通过光镜、电镜观察以及关节液中超氧化物歧化酶(SOD)的测定，探讨用生长抑素关节内注射治疗骨性关节炎的可行性，以期为防治该病提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康的新西兰雄性白兔30只，体重2.5～3.0 kg，由大连大学医学院动物实验中心提供。标准饲料喂养，室温15～25℃，湿度45%～55%，每日正常光照，空气流通，自由摄食、饮水。

1.2 实验药品、器材及试剂

生长抑素 3 mg/支(南京长澳制药)。X光机(日本 岛津) 721分光光度计(上海 生化)台式低温高速离心机(上海 生化)扫描电镜、光镜(日本奥林巴司)SOD试剂盒(沈阳 众和)。

1.3 造模与分组

白兔30只建立骨关节炎模型，模型动物左侧膝关节为实验组，右侧为对照组。根据Hulth造模方法，用5%硫喷妥钠从兔耳缘静脉麻醉后，将兔仰卧捆绑于手术台上，取膝关节内侧纵行切口，长约4 cm，探查关节腔无原发病变，切断内侧副韧带及前交叉韧带，完整切除内侧半月板，逐层缝合伤口，无菌敷料及绷带包扎固定。术后抗炎治疗3 d，分笼饲养，造模后每天训练模型活动1 h，距离400 m左右[1]。

1.4 给药剂量与方法

2周后向实验侧关节腔内注射0.5 mL生长抑素溶液(含生长抑素250 μg)，向对照侧膝关节内注入盐水0.5 mL。1次/周，连续4周。造模后笼中饲养，任其自由活动。于造模后12周抽取实验动物关节液后将其处死，用黄嘌呤氧化酶法测定关节液中SOD的含量，取关节软骨及滑膜进行组织学观察[2]。

1.5 观察指标

①X线观察：处死动物前拍摄兔膝关节正侧位CR片，观察膝关节X线表现。②关节软骨大体观察：实验动物处死后，对照组取股骨内髁，实验组取股骨内髁，肉眼大体观察软骨面情况。③关节软骨组织光镜观察：取股骨内髁关节软骨及滑膜，修整成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织块，切片、HE染色，光镜下按照Mankins评分标准对关节软骨的层次、软骨细胞以及软骨下骨的变化进行观察[3]。 ④关节软骨组织扫描电镜观察：取其股骨内髁软骨，以3%戊二醛前固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，粘托、喷金，扫描电镜观察，拍照[4]。⑤测定关节液中SOD含量：取关节滑膜匀浆液，采用黄嘌呤氧化酶法测各管吸光度值。

1.6 统计学方法

各组数据均采用均数±标准差表示,各组间比较采用两样本均数双侧t检验判断,组内比较用方差分析;P<0.05为差异有显著性意义。

2 实验结果

2.1 兔膝关节正侧位CR 片观察

实验组见膝关节外侧间隙轻微变窄,关节面轻微硬化,未见明显骨赘形成 。对照组可见膝关节内侧间隙明显变大,外侧间隙变窄,呈外翻畸形,关节面硬化,骨端失去正常的对合关系严重者呈半脱位状态,股骨内髁、胫骨平台内侧缘有明显骨赘形成，见图1。

图1 12周模型X线片

2.2 软骨大体观察

实验组打开关节后见关节液量明显少于对照组,软骨色泽变淡,光泽度降低,软骨见软化灶,滑膜可见少量增生。对照组可见关节软骨外观明显失去原有光泽,发黄,色泽变暗淡,尤以股骨内髁为著。大多数软骨面上可见2～3 个长径约3～5 mm的 卵圆形软化灶,滑膜则存在不同程度增生粘连,关节液量增多,未见明显骨赘形成[5]。

2.3 光镜观察

2.3.1 关节软骨光镜下表现：实验组软骨表面光滑,四层结构清晰可辨，软骨细胞排列整齐，潮线完整,染色质均匀分布(图2)。对照组关节软骨表层变薄、粗糙,部分区域成绒毛状,可见较多裂隙从表层软骨延伸向下深达放射层,裂隙中可见稀疏结缔组织及松散的网状连接,部分软骨细胞核固缩坏死,偏于一侧,钙化层软骨细胞呈簇状,软骨细胞排列紊乱,4 层结构不易分辨,潮线多不完整或完全消失(图3)。与对照组比较，第12周实验组Mankins评分结果明显降低。见表1。

表1 第12周实验组与对照组Mankins评分

1)与对照组相比，P<0.05

2.3.2 滑膜光镜下表现：实验组滑膜上皮无增生,间质水肿,有少量淋巴细胞浸润。对照组可见滑膜下毛细血管增生,间质水肿,可见少量淋巴细胞浸润。

2．4 电镜观察

透射电镜观察：实验组可见软骨细胞形态基本正常,细胞器欠丰富,核染色尚可,胶原纤维稍紊乱(图4)。对照组软骨细胞明显固缩、坏死,外形不规则,细胞周晕消失,核膜不明显,表面微绒毛突起减少,胞浆内细胞器凝成高电子密度的片状物不易分辨,可见数个脂滴存在,基质中胶原纤维部分断裂,纤维直径增粗(图5)。

2.5 SOD关节液检测

与同期对照组相比，12周时实验组关节滑液中SOD的含量明显增高(P<0.05)，见表2。

表2 第12周实验动物关节液SOD活力测定结果比较

1)与对照组同期相比,P<0.05

3 讨 论

膝骨性关节炎可以分为原发性和继发性两类。二者引起关节损伤的病理是相同的,即软骨受损,软骨下骨板由于缺乏软骨的保护,受到异常压力而发生代偿性增生(骨赘形成),滑膜发生炎症反应。骨性关节炎的确切病因目前尚未完全明了,但研究表明,自由基、一氧化氮、细胞凋亡、基质金属蛋白酶、细胞因子及生长因子、自身免疫反应、骨内压升高等因素与本病的发病有关[6]。

本实验通过观察OA 模型动物关节软骨的病理变化来探讨生长抑素的治疗作用。实验结果显示:实验组在病理程度上的改变明显较对照组轻,软骨表面裂纹少,胶原纤维结构基本完整,固缩的软骨细胞较少,虽可见部分退变的软骨细胞,但部分软骨细胞具有较多的细胞器,某些区域形成软骨细胞簇,表明软骨细胞通过增强合成和分泌功能来修复软骨。

氧自由基是指在参与各种生物代谢过程中未被完全还原而产生的一系列不稳定的原子、离子、原子团和分子,他们外层电子轨道有不配对电子,性质极其活跃。OA 患者体内有较多的退变坏死的碎屑,为处理这些碎屑,大量多形核白细胞( PMN) 进入关节,由于特殊代谢刺激物的刺激,使其代谢被激活产生大量的氧自由基,一方面破坏正常软骨细胞,另一方面又侵害PMN 本身,造成软骨进一步损害。氧自由基诱发的脂质过氧化反应使基质中胶原纤维发生交联,形成大分子物质,而使胶原蛋白僵硬失去弹性[7]。因此，研究自由基清除剂、提高SOD 活性、保护软骨细胞免受自由基损伤是治疗和预防OA 的重要课题。邵敏[8]采用兔软骨细胞培养技术观察中药补肾活血方对SOD 的影响,从细胞分子水平研究中药补肾活血方防治OA 的作用机制。实验结果表明，中药补肾活血方对软骨细胞的保护作用的可能途径有明显提高SOD 活性,阻止自由基的生成，从而起到保护软骨细胞结构的作用。马建兵[9]也通过实验证明提高SOD的活性而能够清除机体多余自由基,抑制氧自由基对软骨细胞及基质的损害作用,同时能明显降低LPO 的含量,防止继发性损害,从而起到保护软骨及其基质免受氧自由基侵害的作用,进而延缓关节软骨的退变。

生长抑素的生理功能是抑制脑垂体分泌生长激素，调节周围器官的外分泌及内分泌功能，通过抑制感觉神经末梢释放P物质而抑制神经源性炎症反应。P物质被认为是一种神经源性炎症反应的介质，并能通过诱导单核细胞和滑膜细胞相互作用而破坏关节软骨。生长抑素通过抑制P物质，使I型和Ⅱ型感觉神经末梢失去活性而减少疼痛，通过抑制淋巴细胞的增殖和单核细胞的趋化性起到抗炎作用[10]。生长抑素在关节内应用后，生长抑素可作用于不同种类的细胞和组织:抑制滑膜细胞、淋巴细胞的增殖及单核细胞(主要为淋巴细胞)的活化和趋化性;抑制滑膜细胞释放前列腺素。此外，生长抑素还具有收缩血管，减少血浆渗出和水肿;恢复血清滑液屏障的功能，减少关节积液，消除炎症，从而达到缓解疼痛，消除肿胀，改善关节功能的作用[11]。本文实验结果提示，生长抑素还可能通过提高软骨细胞超氧化物岐化酶活性，阻止自由基生成来保护软骨细胞。

生长抑素对OA 的治疗作用机制是非常复杂的,本研究提示其可能是通过提高超氧化物歧化酶水平对OA 产生防治作用的，与透明质酸钠有着相似的疗效。透明质酸钠是已投入临床应用多年，经临床证实对早期OA 有较好防治作用的药物,但有着价格昂贵、不易保存等局限性,而生长抑素有价廉、易保存等优势,存在着开发应用的前景。但是由于药品本身的成分比较复杂,其中真正的有效成分有哪些? 是否同时还存在着损伤软骨的成分? 是否还存在着其他更好的用药途径? 还都有待于进一步研究。

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