动物听觉诱发反应特点及测试技术(2)

鲁海涛 李兴启

1 华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科(武汉 430022); 2 解放军总医院耳鼻咽喉研究所

2.6 大鼠正常ABR波形及识别

2.6.1 典型的ABR波形图形 常包括3个波形，依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。波Ⅲ振幅较高，可达6、7 μV。波Ⅲ后往往有一切迹。波Ⅱ清晰。

2.6.2 ABR各波的出现率 在听力正常豚鼠，90 dB 短声刺激时，波Ⅱ、Ⅲ出现率为100%，波Ⅰ出现率非常低，有时最大刺激声时也未能引出波I。但在低声强时，波Ⅲ出现率最高。

2.6.3 以ABR波Ⅲ出现为判断ABR反应阈的标准：大鼠的波Ⅲ出现最为稳定，振幅相对较高，因此常常以波Ⅲ作为判断阈值的标准(阈值附近衰减档要求5 dB，且必须在记录时做出一条较阈值强度低5 dB未有电反应的曲线)(图4)。

图4 大鼠16 000 Hz ABR不同强度波形 TDT仪器测试。刺激时程3 000 μs，Blackman包络，High pass 100,Low pass 1 500，扫描时间10 ms

2.6.4 峰潜伏期测量 潜伏期的量取其起点一般是从电脉冲给予转换器的时间算起，至电位的起始点为真正的潜伏期。作为研究性的工作则从声音到达鼓膜的时间算起。但电位的起始点很难确定，所以通常以各波的峰尖为电位的“起始”点，以此方法来量取的潜伏期为峰潜伏期。如果波峰不能重复时，则取两个峰的均值，如果波峰是宽的或平滑的，则用延伸线的方法，取其两根斜线的交点。大鼠波Ⅰ出现率很低，峰潜伏期以波Ⅲ为准，可量取Ⅱ-Ⅲ峰间期。

2.7 短纯音或短音诱发ABR的特点

2.7.1 各频率(2、4、8、16、32 kHz)ABR的波形特点 因为ABR是一给声反应，依赖于神经发放的同步化程度，所以上升时间短的刺激是理想的声刺激信号。用短声或用高频的短音都可以引出清晰的可识别的ABR波形，而且随着短音频率的增高波形的清晰度逐渐增加。但当用短音作为刺激时ABR的波Ⅲ潜伏期与刺激音的频率呈反比，即频率高波Ⅲ潜伏期短，而频率低时波Ⅲ潜伏期较长。低频的短音对ABR的形态和振幅影响较大，且这种信号引起的ABR振幅远远小于有短声引导的反应，反应各波波界分化不清，这与神经元的群的同步程度有关。

2.7.2 ABR随频率变化的听反应曲线特点 在采用短音或短纯音刺激声时，ABR阈值在低频时阈值较高，随频率的增加阈值逐渐降低(图5)。

图5 大鼠各频率ABR反应阈曲线

3 豚鼠耳蜗电图(electrocochleography,ECochG)

3.1 动物准备 选用耳廓反射灵敏的豚鼠，全身麻醉后备皮，根据实验要求去除耳后或颈部腹侧的毛发。开放听泡有3种途径：耳后进路，腹正中进路和腹侧进路。

3.1.1 耳后进路 ①动物侧卧，耳后皮肤备皮；②沿耳后沟切开皮肤皮下组织及附着于耳廓的肌肉；③在颈部肌肉附着于听泡的前缘切开肌骨膜，向后分离肌骨膜；④显露白色骨质的听泡，钻一小孔，并扩大开口到直径0.4 cm；⑤从尾端向头侧方向查看，可见开口向上的圆窗龛和圆窗膜。耳后进路相对操作简单，路径短，损伤组织少，但视野相对受限，可以见圆窗龛和鼓阶，不易见到前庭阶和蜗尖。

3.1.2 腹正中进路 ①动物仰卧，四肢及头部固定，备皮；②胸廓上0.5 cm正中切口至下唇，切开皮肤皮下组织，显露颈部带状肌；③从白线处分开两侧颈部带状肌，显露气管；④切开气管，插入通气管或接动物呼吸机，固定。⑤在带状肌外侧和下颌角间分离脂肪及腺体组织，显露乳白色的听泡；⑥去掉茎突舌骨肌，充分显露听泡；⑦打开听泡，注意勿损伤鼓膜。此时可见鼓膜、听骨链、圆窗龛及耳蜗各回，不能窥见圆窗膜。腹正中进路便于显露气管，要求做气管切开的实验可以采用此种进路。

3.1.3 腹侧进路 在下颌骨内侧做切口，其它步骤同颈正中切口。

腹正中进路和腹侧进路开放听泡，路程长，损伤组织多，但可见听泡内视野开阔，可清楚看见鼓膜、听骨链、圆窗龛及耳蜗各回。

3.2 电极制作及位置

3.2.1 银球电极制作方法 用被覆特氟隆的银丝10 cm，在酒精灯下将银丝一头烧成小珠状(直径1 mm)，放入氯化钠溶液中通过直流进行泛极化处理，尾端焊接在记录电极导线上。

3.2.2 圆窗电极 耳后进路开放听泡后可以直接观察到圆窗龛和圆窗膜，将银球电极可以直接放置在圆窗膜上，注意勿损伤圆窗膜。经腹侧进路时，不能窥见圆窗膜，但可见圆窗龛，可将银球电极挂在圆窗龛上。但注意勿放置在面神经沟内。

3.2.3 鼓岬电极(针形电极) 用长约3 cm的细于22号的皮下注射针头或针灸针，除针尖和尾端外均涂以绝缘材料(如聚四氟乙烯、六氟六烯)，尾端焊接到记录电极导线上。电极可经外耳道或开放的听泡放置在鼓岬处。

3.2.4 面神经管电极 ①麻醉豚鼠，耳后切口暴露乳突；②用小棉球紧贴乳突骨壁向骨性外耳道方向分离耳后肌肉和其它软组织直至位于乳突和骨性外耳道之间的面神经充分暴露；③用分离针从面神经管内挑出面神经，将直径为0.5毫米的表面绝缘银丝轻轻插入面神经管内，插入深度约3毫米；④用牙托粉或者生物胶在面神经管口处固定银丝，再调制牙托粉将电极银丝固定于颅顶骨壁。记录电极连接经颅顶引出的面神经管银丝电极线，针形参考电极插入同侧耳垂根部，针形接地电极插入鼻尖。用常规的参数和刺激声即可记录出CM、SP和CAP。银丝电极经面神经管引导耳蜗电位的方法较简便，易于操作，通常用于急性实验或短期存活动物实验。

3.2.5 地线及参考电极 耳后进路时，地极放置在鼻尖，参考电极放置在同侧耳垂。颈侧进路时，地极放置在下唇，参考电极放置在已暴露的肌肉上。

3.3 刺激声选择(根据实验的需求选择)

3.3.1 短声(click)：可用于诱发SP-AP复合波

3.3.2 短纯音(tone burst)：可用于诱发CM、 SP。平台期设置要长(10 ms以上)。诱发CM时采用密波或疏波给声。记录SP时，采用交替给声。

3.3.3 采用tone pip或平台期不长(小于4 ms)的tone burst可做各频率CAP。

3.4 给声方式

3.4.1 扬声器或耳罩式耳机 是将电能转换成为声能并在空气中辐射到远处的电声换能器。不同的扬声器其频响特性不同。有的主要包括中、高频成分，用其测试低频音时就会影响测试结果的准确性。通常扬声器与实验动物耳之间有一定的距离，其发出的声能是在开放声场中传播，因此，其与测试耳的距离亦会影响测试结果。在测试时要固定好扬声器离动物外耳道距离。

3.4.2 耳塞式耳机 目前使用最多的有两种：美国Etymotic Research公司生产的ER-3A和美国Aearo公司生产的EARtone-3A。通常由四部分组成：肩挂式换能器、声管、乳头状转接头和一次性海绵耳塞插头。其优点是可降低环境噪声对测听结果的影响；双耳的耳间衰减可扩展到70～80 dB，可减少测听过程中的掩蔽环节。

3.4.3 刺激声校准 声级计是声学测量的基本装置。目前较为通用的声级计有丹麦B&K公司生产的脉冲精密声级计，其用于开放声场的校准，可以直接读出声压级(SPL)。将声级计的传感器头放置在耳机的正前方，其二者之间的距离必须与测听时耳机和动物外耳道口距离相同。而对于插入式耳机，常用声学耦合器和仿真耳检测。

3.5 ECochG信号采集及记录方法 耳蜗电位包括微音电位(cochlear microphonics,CM)、和电位(summating potential,SP)及复合动作电位(compound action potential,CAP)。

3.5.1 仪器选择 常用听力测试仪包括临床用电反应测听仪和实验室用TDT系统。①临床用电反应测听仪：因临床对人测试时高频常到8 kHz截止，因此，其耳机的高频响应差。在测试8 kHz以上频率时，测试结果失真。②TDT系统(Ⅲ)：是IHS公司开发的专门用于实验室的多功能平台。其耳机频响范围可到1～50 kHz。

3.5.2 增益选择 放大器增益范围在30～100 k。

3.5.3 CAP采集及记录 带通滤波、声刺激间隔、平均次数同ABR。

3.5.4 CM采集及记录 带通滤波(视要求，如果要采集0.5～32 kHz范围的CM，则带通选为0.25～40 kHz),其次刺激间隔、平均次数也要视所用设备、耳机的频响、tone burst的持续时间而定。如tone burst持续时间(上升/下降时间和平台期之和)为10 ms,刺激间隔时间就要长于10 ms,刺激频率就不能多于100次/秒。

3.5.5 tone burst引导的SP记录 带通滤波0～30 Hz, 刺激间隔和平均次数视tone burst的持续时间而定。