登革4型病毒深圳分离株E基因序列测定及其系统发生分析

2010-01-24何建凡冼慧霞何雅青张海龙姚相杰

中国人兽共患病学报 2010年1期

阳帆,何建凡,冼慧霞,何雅青,张海龙,姚相杰,杨洪

阳帆,何建凡,冼慧霞,何雅青,张海龙,姚相杰,杨洪

目的对深圳市2005年从登革热患者急性期血液中分离到的1株登革病毒进行型别鉴定,从分子水平分析分离株的生物学特征,追踪其可能的地域来源。方法用C6/36细胞培养增殖病毒株SZ0524,收集病毒液。用逆转录-半套式PCR(RT-semi-nested-PCR)方法和荧光PCR方法对其进行型别鉴定。扩增病毒 E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革病毒株进行同源性比较和进化树分析。结果深圳市登革病毒分离株用4型特异性引物扩增出392bp的特异性条带,荧光PCR进一步证实了分离的病毒株为登革4型病毒。SZ0524与登革病毒4型国际标准株 H241株在 E基因上核苷酸同源性为99.7%,而与登革病毒1、2、3型国际标准株 HAWA II、NGC、H87同源性分别为57.0%、59.2%和56.2%。基因进化树显示SZ0524株与D4-73N IID株和D4-61N IID株亲缘关系最近,其次为 H241,在进化树的同一分支上,属基因Ⅰ亚型。结论从分子水平证明从深圳市登革热患者血清中分离到的毒株确为DEN-4型病毒。结合流行病学调查资料,证实此病例为输入性感染病例,该毒株最有可能来源于东南亚一带。

登革4型病毒;E基因;序列分析;系统发生树

登革热是由登革(Dengue,DEN)1、2、3和4型病毒引起的急性蚊媒传染病,广泛流行于全球热带和亚热带地区的100多个国家和地区,已成为世界上分布最广、发病率最高、危害较大的一种虫媒病毒性疾病,至今仍无安全有效的登革疫苗应用于预防〔1〕。在我国,登革热主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等几个南方及东南沿海省区,对人类健康造成严重的威胁,成为一个日益严重的公共卫生问题。深圳属于亚热带气候,气候适于媒介伊蚊的生长繁殖,且处于登革热流行地区的包围之中,对外交往多,人员流动性大,近年来都有到东南亚、太平洋地区、非洲等地回国感染登革热的输入性病例,疫情多呈散发。

目前,利用分子生物学技术和新兴的生物信息学方法对登革热的病原学、病毒基因序列分析、流行病学等方面进行研究,探讨基因序列改变及其分子进化特征,从不同毒株地理来源等方面了解其致病机制,对于登革热的预防、控制具有重要意义。深圳市2005年夏秋季陆续发现疑似登革热患者,其主要临床表现为发热、头痛、肌痛、关节痛及皮疹伴淋巴结肿大。根据流行病学资料和血清学检测,初步诊断均为输入性登革病毒感染。本实验室从一患者急性期血清中分离到一株登革病毒株,采用刘建军等人报道的M GB荧光 PCR方法〔2〕对其进行了鉴定,从病原学上证实为登革感染,但一直未知其具体型别、分子结构特点,对病毒来源亦缺乏依据。本研究通过对分离株SZ0524 E基因全序列测定,分析其结构特点,从分子水平确定其型别,并构建系统进化树,与国际参考株和国内分离株进行同源性比较,追踪其可能的传染来源,为正确了解登革病毒在深圳市的流行病学概况提供了重要的线索。

1 材料和方法

1.1 病毒株及细胞登革病毒株SZ0524为用白纹伊蚊传代细胞(C6/36细胞)自登革热病人血清标本中分离得到,由本实验室分离、鉴定,-80℃保存至今。C6/36细胞由本室液氮保存,复苏后用含10%胎牛血清的50%M EM+50%RPM I-1640培养液,于28℃、5%CO2条件下常规传代培养。登革病毒DEN 1-4型标准株(1型 Haw aii株、2型 New Guinea C株、3型 H 87株和4型 H241株)由广东省疾病预防控制中心微生物检验所惠赠。

1.2 主要试剂 M EM、RPM I-1640培养基、胎牛血清均购自 Gibco公司。M-MLV酶(D2640A)、PrimeSTAR高保真 Taq酶(DR010A)、DNA Ladder M arker(D505A)均购自 TA KARA公司。

1.3 病毒增殖按照文献方法〔3〕,用 C6/36细胞28℃常规培养和传代病毒,待75%细胞出现病变时收获感染细胞和培养液,-80℃保存。

1.4 登革病毒型别鉴定按照文献〔4〕方法进行逆转录-半套式PCR分型鉴定。同时采用上海之江生物科技有限公司生产的登革病毒(1-4型)核酸荧光PCR分型检测试剂盒对分离的毒株进行型别鉴定,具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.5 登革病毒E基因序列的测定

1.5.1 引物设计与合成利用 Primer软件,参照DEN-4型国际标准株 H241株设计两对重叠引物分段扩增E基因片段,预期扩增序列完全覆盖 E基因区域。具体序列见下表1,均由TA KARA公司合成。

表1 登革病毒E基因引物序列Table 1 The Primers used for amplification of E genes of dengue virus

1.5.2 病毒 RNA提取采用 Roche公司 High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA,具体操作参见试剂盒说明书。

1.5.3 反转录及PCR 采用常规方法用M-MLV进行逆转录。即取RNA,加入反向引物,70℃作用10 min后,立即插入冰浴中保持2 min以上,依次加入RNase Inhibitor,5×缓冲液,dN TP及M-MLV反转录酶,加水至总体积20μL,42℃保温60 min进行反转录。反应完毕,70℃15 min灭活cDNA作为 PCR模板。取 cDNA,5×PCR缓冲液,dN TP,正向引物,反向引物,PrimeSTAR高保真Taq酶,补水至总体积50μL进行 PCR。反应参数为:98℃2 min,98℃10 s、56℃15s、72℃60s,30个循环,72℃再延伸7min。

1.5.4 PCR产物的鉴定和测序用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,凝胶成像系统观察分析并记录结果。获得的 E基因区 PCR产物由TA KARA公司纯化后使用AB I373 DNA序列自动测序仪进行序列测定。所有PCR产物经正、反方向测序,互补配对验证后,用软件拼接成完整的 E基因序列。

1.6 同源性分析与系统发生树研究利用NCBI BLASTn对 GenBank数据库进行同源性检索,并应用Clustslx(1.83)和DNAStar软件进行排序、比较分析建立系统进化树,其他已知参考序列片段来源于 NCB I的 GenBank。

2 结果

2.1 登革病毒的型别鉴定逆转录-半套式 PCR用型特异性引物扩增后,获得392bp的DEN-4型特异性带(图1),与预期的分子量相符,阴性对照未见任何条带。未扩增出其他型别的特异带,证实分离到的SZ0524为DEN-4型。另外采用登革病毒(1-4型)核酸荧光PCR检测试剂盒对SZ0524株进行基因分型,结果登革4型病毒出现明显的“S”型曲线峰图,登革1、2、3型病毒和阴性对照均没有出现峰,这也证实了所分离到的登革热毒株SZ0524为登革4型。这是深圳市首次从输入性登革热患者血清中分离出登革4型病毒。

图1 型特异性引物PCR扩增登革病毒分型Fig.1 PCRam plification with type-specific primers M.100bp DNA ladder;1.postive control;2.amp lification of the SZ0524 with DEN-1 specific primers;3.amp lification of the SZ0524 with DEN-2 specific primers;4.amp lification of the SZ0524 with DEN-3 specific primers;5.amp lification of the SZ0524 with DEN-4 specific primers;6,7.negative control

2.2 SZ0524株 E基因序列测定结果将DEN4-SZ0524株经上述 E基因测序引物扩增后,均扩增出相应的目的条带。分别进行测序后将测序结果利用软件拼接组合成完整的E基因序列,核苷酸序列长度为1 485bp,编码495个氨基酸,未发现有碱基的缺失和插入。据文献报道,登革4型病毒在67位(N-I-T,67-69)和153位(N-D-T,153-155)存在两个保守的N-联糖基化位点〔5〕。而SZ0524株的E基因在464位有1个碱基发生变异(由C→T),导致推导出的氨基酸在155位由苏氨酸(T)→异亮氨酸(I),由亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸,使得丧失E153位的N-联糖基化位点,可能会对抗原性产生影响。

2.3 SZ0524株与登革病毒分离株的比较将SZ0524 E基因核苷酸序列输入 GenBank数据库进行Blastn检索,结果发现序列相似度最高的均为DEN-4型病毒,进一步证实了该毒株为DEN-4型。该分离株 SZ0524与登革病毒4型国际标准株H241株核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.2%。而与登革病毒1、2、3型国际标准株 HAWA II、NGC、H87株核苷酸同源性分别为57.0%、59.2%和56.2%,氨基酸同源性分别为62.6%、63.4%和62.4%。与D4-73N IID株(分离自1973年输入至日本的病人标本)和D4-61N IID株(分离自1961年输入至日本的病人标本)核苷酸同源性最高,达99.9%,氨基酸同源性为99.8%。与中国广州分离的DEN-4病毒B5株核苷酸同源性为97.7%,氨基酸同源性为98.8%。

2.4 SZ0524株系统发生树分析为了明确深圳市SZ0524株与世界其它流行区分离株之间的亲缘关系,探讨流行来源,我们对其进行了进化分析。Lewis JA等〔6〕认为全长的E蛋白基因是研究登革病毒的分子流行病学的最适区段。根据文献报道〔7-8〕,登革4型病毒分为森林株和地方流行株,后者可划分为基因Ⅰ型和Ⅱ型,其中基因Ⅱ型又分为ⅡA和ⅡB亚型。基因Ⅰ型主要为东南亚和中国株,基因ⅡA亚型主要为东南亚和中国株,基因ⅡB亚型主要为拉丁美洲、太平洋群岛和东南亚株。因此,我们将SZ0524株 E基因序列与国际标准株和其他国内外分离株以及登革1、2、3型国际标准株进行同源性比较。分析表明核苷酸序列同源性在56.2%～99.9%之间,推导的氨基酸同源性在62.4%～99.8%之间。从系统发生树(图2)中可见,SZ0524与D4-73N IID株和D4-61N IID株系统进化关系最近,其次为登革4型病毒国际标准株 H241,而与登革1型、2型和3型距离最远。且与 Thailand 1978、Philippines 1964和B5株等位于相近的分支,按照文献报道标准对DEN-4基因亚型的划分,H241、Thailand 1978、Philippines 1964和B5株都属于基因Ⅰ型,因此我们将DEN4-SZ0524划分为基因Ⅰ型。

图2 登革4型病毒分离株SZ0524 E基因的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of nucleotide sequences of E gene of virus type 4 SZ0524 strain

3 讨论

通过对不同地区流行株的分离、鉴定,进而比较不同地区、不同时间登革流行株的遗传差异,从基因水平上追踪分析传染源,从而发现某一流行事件是过去流行株的复发还是从外界传入的新毒株,是目前登革病毒分子流行病学调查研究的主要手段之一。同时该技术有助于对国内登革热流行规律的认识,为我国登革热的流行病学监测及制定有效的预防措施提供理论依据〔9〕。由于常有输入性病例以及登革病毒的传播媒介在我市普遍存在,因此登革热在我市局部暴发流行的潜力相当大。如不加强登革热传染源和媒介的控制,将很可能引发流行或暴发流行。

本研究首先用逆转录-半套式PCR和荧光PCR方法对深圳市分离株SZ0524进行了型别确定,对其 E基因进行了序列测定,从分子水平上进一步证实确为登革4型病毒,并建立系统发生树,以了解这一毒株的流行来源和生物学特性。结果显示SZ0524 株与 H241、Thailand 1978、Philippines 1964和Sri Lanka 1978等同属于基因Ⅰ型。该分离株与两株输入至日本的D4-73N IID株和D4-61N IID株(两株E基因核苷酸序列一致)系统进化关系最近,核苷酸同源性均为99.9%,其次为登革4型国际标准株 H 241,核苷酸同源性为99.7%。由于此两株输入至日本的毒株具体来源未知,利用NCB IBLASTn对 GenBank数据库进行同源性检索发现与其同源性最高的为 H241株,据报道 H241株分离自1956年菲律宾发热病人,是菲律宾当时的流行株,此外,根据现场流行病学调查,感染该分离株SZ0524的病人在2005年8-9月期间曾于新加坡学习逗留一段时间后返回深圳,据此推测出该次登革热的感染源自境外相关地区,该毒株最有可能来源于东南亚一带,属于输入性传染,这与流行病学调查资料一致。

DEN的E蛋白全长495个氨基酸,位于病毒毒粒表面,构成毒粒的突起,是主要的胞膜蛋白,决定着病毒的组织亲嗜性,并介导病毒与细胞受体的结合。同时它还是影响病毒毒力,引起保护性免疫应答及免疫病理损伤的重要成分。该蛋白的变异可能导致毒力变化,并引起疾病症状的变化。根据 E基因序列分析及带二硫键的不同抗原决定簇的结构特性,提出了一种 E蛋白结构模型:该模型主要由3个不重叠的抗原区A、B和C组成。因此,此研究选择对SZ0524株进行 E基因序列测定,从序列分析发现与病毒毒力相关的位点。据文献报道〔10〕,E蛋白区在E155位由苏氨酸(T)→异亮氨酸(I),由亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸,抗原性发生较大变化,可能对病毒的毒力产生影响。DEN-4病毒的E155位氨基酸残基位于结构域 A区。Kawano等〔11〕利用登革4型高神经毒力和低神经毒力病毒构建型内嵌合病毒,并进行点突变后分析,发现E155为氨基酸残基由 T转变为I后,登革4型病毒E蛋白潜在的两个保守的N联糖基化位点之一(A sn-153位)发生改变,使A区的抗原位点发生改变,从而使病毒毒力转强。我们的测序结果显示SZ0524株在E蛋白区155位为异亮氨酸(I),根据文献报道可能是一强毒力位点,因此我们推测SZ0524很可能为强毒株,对于E蛋白的变异与其毒力、致病性的关系的研究,有待今后进一步开展。这次对深圳市分离到的4型登革病毒株的研究为型特异性E抗原基因的克隆、表达奠定了基础,从而深入了解病毒致病的分子机制,为我市登革热的传播来源、疫情流行特点、预防控制提供了科学依据。

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Sequence determ ination and phylogenetic tree analysis of the E gene of dengue virus type 4 isolated from a patien t in Shenzhen

YANG Fan,HE Jian-fan,XIAN Hui-xia,HE Ya-qing,ZHANG Hai-long,YAO Xiang-jie,YANG Hong

(Shenzhen Center for D isease Prevention and Control,Shenzhen 518020,China)

To identify the genotype and analyze the molecular characteristics of dengue virus strain SZ0524 isolated from serum samples of patients with early stage of dengue fever in Shenzhen in 2005 so as to exp lo re its possible origin.The C6/36 cell line was cultivated with virus strain SZ0524 and its suspension was harvested.The type of isolated virus strain was determined by RT-semi-nested PCR and fluorescent PCR.E gene of isolated virus strain was amplified by RT-PCR and sequenced.Homology and phylo genetic tree of E gene of this dengue virus with the strains isolated from other areas were constructed.This SZ0524 strain was further identified by fluorescent PCR,and confirmed to be the type 4 virus after obtaining the 392bp band with type 4 specific primers.The homology of nucleotide sequence of E gene of SZ0524 strain with the standard type 4 dengue virus H241 strain were 99.7%,but the homology with the standard dengue virus 1,2,3 in the same fragment were 57.0%,59.2%and 56.2%respectively.Analysis of the phylo genetic tree indicated that SZ0524 was more close to D4-73N IID and D4-61N IID strain,next to H241 strain,and they lied in the same branch of phylogenetic tree.The isolated dengue virus type 4 belonged to genotypeⅠand the SZ0524 strain was p roved to be dengue virus type 4 in themolecular level.Combined with epidemiology information,it is suggested that this case can be classified as an imported case and the SZ0524 strain may be transferred from the southeast asian region.

dengue virus type 4;E gene;sequence analysis;phylogenetic tree

R373.3

1002-2694(2010)01-0017-04

深圳市疾病预防控制中心微生物检验科,深圳 518020;Email:sailing_728@163.com

2009-06-07;

2009-10-26