用生物信息学方法预测2型猪链球菌98HAH33细胞壁结合蛋白＊

孙理云

用生物信息学方法预测2型猪链球菌98HAH33细胞壁结合蛋白＊

孙理云

目的 为预测已公布基因组序列的2型猪链球菌(SS2)98HAH33株的细胞壁结合蛋白,以研究它们在SS2致病过程中的作用。方法首先从 GenBank获取由SS2 8HAH33基因组推测蛋白质氨基酸序列,然后根据分选酶底物的结构特征,采用“三部分模式”法鉴别分选酶底物;采用手动方法寻找在具有I型信号肽的蛋白质中具有LysM域、W xL域、胆碱结合域、GW域或S层同源域的蛋白质;利用InterProScan和BlastP服务器,对鉴定的蛋白质进行功能分析。结果共预测出9种分选酶底物,2种具有LysM域的蛋白。YP_001201232、YP_001201531和 YP_001201656等3种已证实位于SS2菌体表面;其中 YP_001201232为已知毒力因子OSF。另外4种蛋白质的功能分析表明,YP_001201484为糖苷酶,YP_001201544为枯草杆菌素样丝氨酸酶,YP_001199825和 YP_001199755可能结合 H因子,可能为新的毒力因子。YP_001200959、和 YP_001201233等2种功能未知。结论提示SS2的多数分选酶底物可能为SS2的毒力因子,与致病过程相关。

细胞壁结合蛋白;猪链球菌2型;生物信息学;毒力因子

2型猪链球菌(Streptococcus suis type2,SS2)是革兰氏阳性、溶血性兼性厌氧的球菌,主要可引起猪和人的脑膜炎、关节炎、败血症及猝死,是一种重要的人兽共患病细菌。我国分别在1998年江苏省和2005年四川省在猪群和人群中暴发流行猪链球菌病并引起死亡,引起了社会的广泛关注。引起这两次暴发疫情的病原体均为 SS2强毒株〔1-2〕。但其致病机制及毒力因子尚不甚清楚。

革兰氏阳性菌的一些表面分泌蛋白通过共价和非共价连结与细胞壁结合,共价结合的蛋白为分选酶的底物,分选酶裂解底物的LPXTG基序与之于肽聚糖共价结合。非共价结合的蛋白均有特殊的结构域或基序与细胞壁的成分通过非共价结合而锚定于细胞壁,如LysM域和W xL域介导与肽聚糖的非共价结合、胆碱结合域与脂壁酸的胆碱结合、GW基序与细胞壁脂壁酸结合、S层同源域与细胞壁结合〔3〕。

分选酶是 G+细菌的一种胞膜结合的转肽酶,催化的底物是具有如下特点的蛋白质:N端有信号肽用于蛋白质通过I型分泌途径转运出细胞质膜;C端的分选信号约有30～40氨基酸,具有LPXTG基序,在该基序之后有一疏水性的跨膜区,C端的最后8个氨基酸至少有一个碱性氨基酸(R或 K)。分选酶在C端LPXTG基序的 T和 G间裂解表面蛋白,通过C端和细胞壁肽聚糖形成的酰胺键的形成而将这类底物锚定到细胞壁上〔4〕。基于 G+细菌分选酶底物蛋白的特征,人们已建立起预测其的方法〔5〕。

业已证实多种G+致病菌的分选酶变异株毒力降低与锚定于细胞壁的蛋白质相关。SS2有5-6种分选酶〔6-7〕,近已证实SS2的 SrtA与 SS2的毒力有关〔8-9〕。迄今已鉴别的 SS2分选酶底物蛋白不多,其中溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,M RP)是 SS2的一种毒力标志〔10〕、猪链球菌浑浊因子(opacity factor of S.suis,OFS)与毒力有关〔11〕,表面抗原 1(surface antigen one,Sao)具有免疫保护作用〔12〕。SS2有其它什么分选酶底物,它们在细菌毒力方面起何种作用,未见报道。此外,SS2细胞壁是否有非共价结合的蛋白也未见报道。为此,本文采用生物信息学法对已公布的国内SS2致病株98HAH33基因组进行分析,推测出该株菌具有9种可能的分选酶底物蛋白和2种具有LysM域的蛋白,对它们可能的作用进行了预测分析,为进一步的研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 SS2致病株98HAH33基因组推测的蛋白质及氨基酸组成序列由 GenBank获得。该菌基因组登陆号为NC_009443,编码2185种蛋白质。1.2 分选酶底物的鉴别 采用Jos Boekhorst的“三部分模式”法进行鉴别〔5〕。首先手工找出最后40个aa中具有LPXTG基序的蛋白质,然后利用Phobius(http://phobius.binf.ku.dk/)〔13〕鉴别出具有信号肽及信号肽的裂解位置、LPXTG基序之后具有疏水性跨膜区的蛋白质;其后手工检测出 C端最后8个aa有至少一个极性或带电aa(R或 K)的蛋白质即为分选酶底物。

1.3 细胞壁非共价结合蛋白的鉴别 利用Phobius(http://phobius.binf.ku.dk/)预测出具有信号肽的蛋白质,手动分析找出具有LysM域、W xL域、胆碱结合域、GW域和S层同源域的蛋白质。

1.4 功能分析 利用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)程序检测每一预测蛋白的功能域,利用BlastP(http://beta.unip rot.org/?tab=blast)寻找出同源蛋白质,结合98HA H33基因组注释进行功能分析。

2 结 果

2.1 分选酶底物

2.1.1 鉴定结果 在98HA H33基因组中发现YP_001199741、YP_001199755、YP_001199771、YP_001199825、YP_001199827、YP_001200023、YP_001200025、YP_001200313、YP_001200370、YP_001200536、YP_001200571、YP_001200785、YP_001200886、YP_001200944、YP_001200959、YP_001201081、YP_001201232、YP_001201233、YP_001201484、YP_001201531、YP_001201544、YP_001201625和 YP_001201656等23种蛋白在最后40个aa中具有LPXTG基序且C端最后8个aa至少1个为极性或带电aa(R或 K),经 Phobius分析发现9种蛋白质N端具有信号肽(表1)。

2.1.2 信号肽分析 在98HA H 33基因组所鉴定的9种分选酶底物中,信号肽长度在25-55个aa之间,平均35.1;N结构域6-31个aa之间,平均15.5;9个 H结构域有7个为12aa残基长,另外1个11aa,1个9aa;C区4-12aa,平均8±3.08。

2.1.3 分选信号肽分析 在98HAH33基因组所鉴定的9种分选酶底物中,分选信号肽长度在31-38个aa之间,平均34.3±2.4;跨膜域长度 18-22个aa,18aa长的2个,19aa长的4个,20 aa长的2个,22aa长的1个,平均19.3±1.2;带正电荷的尾巴长度在5-9个aa范围之间,至少2个正电荷的氨基酸。分选酶识别的基序为〔L I〕P〔N KQASV Y〕TG。2.1.4 功能分析 YP_001199755具有 G5结构域PF07501(416-493aa)和细胞表面抗原结构域PD153432(346-409)。与肺炎链球菌的 Hic有28%(139/483)的一致性〔14〕,与四川株 YP_001197564具有99%(560/561)的一致性 YP_001199825原注释为翻译起始因子2GTPase,但在其上仅发现两个高迁移率族蛋白结构域 PD005593(515-528aa)和(595-613aa)及位于二者之间的细胞表面抗原结构域 PD153432(529-594aa),也发现保守域PRK10263(DNA translocase FtsK)(566-665aa),FtsK参与细菌细胞的分裂。该蛋白与肺炎链球菌的 Hic有 34%(129/379)的一致性〔14〕,与无乳链球菌的Cβ蛋白有44%(77/173)一致性〔15〕。与四川株的 YP_001197640具有100%(698/698)的一致性。

表1 预测的分选酶底物分泌信号肽和C-端分选信号肽Table 1 Secretion and sorting signal peptides of predicted sortase substrates of SS2 isolate 98HAH33

YP_001200959原注释为淀粉酶结合蛋白B,与四川株的 YP_001198753有98%(580/590)的一致性。具有肽酶域PF03577(25-447)。

YP_001201232具有 von Willebrand factor,type A超家族 cl00057(133-266aa);与登陆号AAX56334的猪链球菌的血清浑浊因子(OSF)有99%(931/938)的一致性〔11,16〕。与停乳链球菌的纤连蛋白结合蛋白FnBA具有38%(287/749)的一致性,该蛋白具有浊化血清作用〔17〕。与M 2型化脓链球菌的毒力因子血清浑浊因子有33%(277/836)的一致性,该蛋白具有纤连蛋白结合特性〔18〕。

YP_001201233未见蛋白结构域或家族。为功能未知的蛋白质。与四川株的 YP_001199030具有100%(698/698)的一致性。

YP_001201484具有糖基水解酶家族85 PF03644(198-510aa),盘状素家族 PF00754(790-920aa)和2个可在多种细菌表面蛋白中发现的细菌Ig样结构域(群3)家族 PF075232(1034-1104aa和1123-1192aa),具有内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶D保守域COG4727(152-670aa),与肺炎链球菌的内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶D有 55%(759/1355)的一致性〔19〕。

YP_001201531具有内切核酸酶/外切核酸酶/磷酸酶家族 PF03372(649-952),2个 YhcR_OBF_like保守域cd04489(201-271和414-470aa)和推测的胞外核酸酶保守域COG2374(154-960);与 SS2分离株 SX332的 SsnA有98%(1023/1043)一致性〔20〕。

YP_001201544具有枯草杆菌素样丝氨酸蛋白酶家族 PF00028(228-665aa)和未知功能域PF06280 (Domain of Unknow n Function DUF1034)(737-859aa)。与肺炎链球菌的毒力因子枯草杆菌蛋白酶 PrtA具有29%(318/1079)一致性〔21〕,与地芽孢杆菌MO-1的胶原裂解蛋白酶具有29%(293/1003)一致性〔22〕。

YP_001201656具有钙调磷酸酶样磷酸酯酶蛋白家族 PF00149(115-353aa)、5’-核苷酶 C-端域蛋白家族 PF02872(447-644aa)、6个 PR01607结构域(5’-核苷酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)、PS00786结构域(5’-核苷酶)、PTHR11575(5’-核苷酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)和 PTHR11575:SF6(2,3-环核苷2-磷酸二酯酶)。与 SS NCTC10234株登陆号为BAB83969的推定的环核苷磷酸二酯酶 SntA有99%(811/813)的一致性〔23〕。

2.2 细胞壁非共价结合蛋白 仅发现2种具有LysM域的蛋白,未发现具有其他结构域或基序的蛋白。它们分别为 YP_001199784和 YP_001201729。其中 YP_001199784由343氨基酸组成,信号肽长49个氨基酸,N区1-27氨基酸,H区28-38氨基酸,C区39-49氨基酸,LysM域PF01476在73-116氨基酸之间;与无乳链球菌的表面免疫原蛋白Sip有一致性。

YP_001201729有192个氨基酸,信号肽长38个氨基酸,N区1-19氨基酸,H区20-31氨基酸,C区32-38氨基酸,LysM域在41-84之间。

3 讨 论

革兰氏阳性菌具有多种细胞外蛋白,其中一些对于细菌适应环境存活起着重要作用。对于病原菌,表面蛋白在黏附侵袭宿主组织、逃避宿主免疫方面起着重要作用。鉴别这些蛋白弄清其在细菌致病过程中的作用,研制有效诊治这些致病菌所致疾病的方法具有重要意义。

细菌的一些细胞蛋白表达量少,有些是环境条件调节表达的,通过传统的试验难以获得鉴定,而通过生物信息学的方法可以弥补其不足。本试验在预测我国SS2分离株98HA H33和05ZYH33与细菌细胞膜结合的脂蛋白基础上〔24-25〕,又对结合于细胞壁的蛋白进行了预测。

本研究预测出98HA H 33有9种分选酶底物,业已试验证实其中的 OSF(YP_001201232)〔11〕、SsnA(YP_001201531)〔20〕〕和 SntA(YP_001201656)〔23〕3种蛋白质锚定于细菌的细胞壁,说明预测方法可靠。在这3种蛋白中,已证实OSF与SS2的毒力有关〔11〕。

另外4种预测的蛋白质 YP_001201484、YP_001201544、YP_001199825和 YP_001199755在细菌致病过程中的作用,值得关注。与 YP_001201484同源的肺炎链球菌内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶D可作用于IgG的门冬酰胺连接的寡糖核心结构〔26〕。因此推断 YP_001201484作为位于细菌细胞外的糖苷酶作用于宿主组织或免疫分子而起侵袭或逃避免疫作用。

Vanier等〔8〕证实SS2的 SrtA基因变异导致细菌粘附I型胶原的能力明显减小,参与粘附 I型胶原的表面蛋白很可能是 YP_001201544,因为其与结合胶原的芽孢杆菌 MO-1胶原裂解蛋白酶同源〔22〕。肺炎链球菌的PrtA是肺炎链球菌的毒力因子〔21〕,与之同源的 YP_001199348,很可能是 SS2 的毒力因子。

补体系统的 H因子具有协助 I因子裂解C3b为iC3b,阻止C3b-Bb复合体(旁路途经C3转化酶)的形成。肺炎链球菌的 Hic与 H因子结合抑制了补体系统旁路激活途径,使得细菌逃避体液免疫〔14〕。YP_001199825和 YP_001199755与 Hic同源,它们也许使细菌逃避宿主的免疫。

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Putative cell wall-binding proteins of Strep tococcus suis serotype 2 isolate 98HAH33 identified by bioinformatic genome analysis

SUN Li-yun
(College of L ivestock Science&Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

To identify the cell wall-binding proteinsof Strep tococcus suis serotype 2(SS2),acco rding to their structure feature,the substrates of so rtase and I type secreted proteins with LysM domain,W xL domain,choline-binding domain,GW domain or S layer homologous domain in the recently published genome of SS2 strain 98HAH33 were firstly identified and then the putative functions were attributed to individual proteins by reference to the identification of conserved domains of Inter Pro and BlastP servers.Homologous proteins were identified by unfiltered BlastP homology searches(including conserved domain detection).Among the 23 putative proteins with a C-terminal LPXTG recognition signal for covalent attachment to pep tidoglycan by sortase,9 with I signal pep tide were identified as so rtase substrates.Among 9 substrates,YP_001201232,YP_001201531 and YP_001201656 had been experimentally verified to anchor to bacterial cell wall,and YP_001201232 know n as the opacity factor of S.suis(OFS)wasp roved to be the virulence facto rs.According to function analysis,YP_001201484,YP_001201544,YP_001199825,YP_001197640,YP_001197840 and YP_001199755 appeared to be involved in SS2 pathogenesis.and YP_001200959,YP_001201233 and two proteins with LysM domain(YP_001199784 and YP_001201729)were the hypothetical proteins.These data suggest the majority of putative sortase substrates may imp licate in the virulence of SS2 and could serve as a basis for targeted experimental studies into the function of these proteins.

cell wall-binding protein;Streptococcus suis type 2;bioin formatics;virulence factors

R378

A

1002-2694(2010)01-0072-04

＊河南科技大学人才科研基金(05-10);河南科技大校科学研究基金(2006ZY042)

河南科技大学动物科技学院,洛阳 471003;

Email:sunliyun8891@sina.com.cn

2009-07-13;

2009-10-19