Mu-、kappa-、delta-阿片受体在成年大鼠正常胃组织的免疫组织化学定位研究

李成龙，屠伟峰，张 伟，陈晓东

1.广东省第二中医院麻醉科(广东 广州 510095) 2.广州军区广州总医院全军临床麻醉中心(广东 广州 510010) 3.广州军区广州总医院病理科(广东 广州 510010)

阿片肽是中枢神经系统和胃肠道中广泛存在的一种重要的脑肠肽，它对胃肠道的动力、酸分泌、水电解质转运等具有多重影响。阿片肽及阿片受体对不同类型的胃粘膜损伤模型有着不同的影响，保护作用和恶化作用均有报道[1～6]，这些研究结果的分歧可能与不同类型模型的胃粘膜损伤机制的差异有关系。故本研究采用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)，对mu-阿片受体(MOR)、kappa-阿片受体(KOR)、delta-阿片受体(DOR)在大鼠胃组织的分布进行定位分析，探讨阿片受体在胃发挥各种生物学功能及胃粘膜的损伤、修复与再生中的作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器主要试剂 兔抗MOR多克隆抗体(Chemicon公司，美国)，兔抗DOR多克隆抗体(Chemicon公司，美国)，兔抗KOR多克隆抗体(Santa cruz公司，美国)，SP试剂盒(广州深达生物公司)。主要仪器CS-Ⅵ型摊片烤片机(孝感巿宏业医用仪器有限公司)，BM-Ⅶ生物组织包埋机(孝感巿宏业医用仪器有限公司)，石蜡切片机(广州锦绣仪器公司)，显微镜(日本OLYMPUS)。

1.2动物选择成年雄性Wistar大鼠24只，16～20周，体质量200±20 g，南方医科大学医学实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 动物取材 采用颈椎脱臼法处死大鼠，打开腹腔，暴露胃。用细线结扎贲门与幽门，取胃， 4%多聚甲醛5 ml胃腔注射。10 min后，沿胃大弯剪开平铺，用冰盐水冲洗胃腔，剪取胃窦、胃体等处胃组织，大小约为1 cm×1 cm，4%多聚甲醛固定8 h，石蜡包埋备用。

1.3.2 免疫组化染色 切片；蜡笔画圈；常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水；柠檬酸(pH7.4～7.6)高温抗原修复20 min；30 ml/L H2O2孵育20 min；滴加1% Triton X-100封闭30 min；滴加一抗(稀释度1∶500)并4℃过夜；滴加二抗(稀释度1∶1500)，室温下孵育60 min；滴加辣根过氧化酶(HRP)标记的链酶卵白素，室温下孵育10 min；每步骤后均经0.01 M PBS冲洗5 min×3次；苏木素复染；脱水、透明、封片。用PBS液代替一抗做阴性对照，步骤同前。

2 结果

2.1阿片受体在胃组织各部位的阳性反应程度见表1。

2.2正常胃组织HE染色图A为胃粘膜层(HE×200)，黑色箭头部分为胃粘膜粘液层及上皮层；图1B为胃粘膜腺体区(HE×200)，黑色箭头部分为壁细胞，光镜下可见壁细胞，细胞膜边界明显，胞浆呈嗜酸性，HE染色呈淡红色，壁细胞周围为主细胞；图1C为胃粘膜肌层(HE×400)，肌间神经丛分布于纵形肌与横行肌交界处。黑色箭头部分为肌间神经丛，光镜下神经元细胞核大而不规则，可见核仁。图1见封三。

表1 胃组织μ-、δ-、κ-阿片受体阳性反应颗粒的分布

注：-阴性反应，+轻度阳性反应，++中度阳性反应，+++重度阳性反应

2.3 mu-阿片受体在胃组织的分布MOR免疫反应阳性棕色颗粒主要分布于胃粘膜粘液层及上皮细胞层(图2A图黑色箭头)、胃主细胞的胞膜及胞浆(图2B图黑色箭头)、胃粘膜下肌间神经丛(图2C图黑色箭头，图2见封三。)。

2.4 kappa-阿片受体在胃组织的分布KOR免疫反应阳性棕色颗粒主要分布于胃主细胞的胞膜及胞浆(图3B图黑色箭头)、胃粘膜下肌间神经丛(图3C图黑色箭头)，而胃粘膜粘液层及上皮细胞层KOR免疫反应呈阴性。图3见封三。

2.5 delta-阿片受体在胃组织的分布DOR免疫反应阳性棕色颗粒主要分布于胃主细胞的胞膜及胞浆(图4B图黑色箭头)、胃粘膜下肌间神经丛(图4C图黑色箭头)，而胃粘膜粘液层及上皮细胞层DOR免疫反应呈阴性。图4见封三。

3 讨论

阿片肽与阿片受体作用可引起细胞膜的超极化和降低胆碱能快兴奋性突触后电位的幅度，通过阻断动作电位的传导或引起突触前抑制以减少Ach的释放。阿片肽对胃肠道功能有多重影响，如胃肠动力、酸分泌、水电解质转运等。然而，阿片类药物及阿片肽对不同类型的胃粘膜损伤有着不同的影响，保护作用和恶化作用均有报道[1～6]，这表明阿片肽及阿片类药物对胃黏膜的保护与损害作用取决于阿片受体在胃组织各层功能细胞上的分布及其阿片肽对胃组织细胞功能的影响。

本研究显示，mu-阿片受体阳性颗粒主要分布于胃黏膜上皮及黏液层、胃主细胞、肌间神经丛这些区域，且主要表达在胞浆和胞膜，这似乎表明阿片肽可以通过阿片受体抑制胃黏膜表层黏液的分泌、抑制胃蛋白酶的分泌、影响胃平滑肌的紧张性和收缩频率。Del Tacca M[2]等人的研究发现，腹腔给予morphine能剂量依赖性抑制胃分泌液的容量、酸度、胃蛋白酶的产量和胃结合粘蛋白数量，而morphine对胃溃疡的影响是非剂量依赖性的，腹腔5 mg/kg的剂量能显著增加胃损害，腹腔给予Naloxone能预防morphine对胃分泌液的容量、酸度、胃蛋白酶产量的影响，但对为粘液和溃疡评分没有影响，脑室给予morphine能剂量依赖性抑制胃分泌液的容量、酸度和胃溃疡评分，而对胃粘液没有影响，脑室给予Naloxone则能预防morphine上述效应，这些研究结果表明morphine对胃分泌抑制效应是通过中枢和外周机制来实现的，而对粘液的影响则是通过外周阿片受体作用来抑制其合成，并且屏障粘液合成的抑制可能部分参与了morphine致溃疡作用。然而，Tazi-Saad & Del Tacca等[3]人的研究结果则得出上述相反的结果。他们研究了morphine对indomethacin、aspirin、taurocholic acid 三种药物复制的大鼠胃溃疡动物模型幽门结扎后胃分泌、粘液屏障、粘摸损伤的影响。结果显示：三种致溃疡药物诱导明显的胃粘膜损伤，morphine减少胃酸分泌并抑制aspirin、taurocholic acid诱导的粘膜损伤，对indomethacin诱导的损伤没有影响，提示indomethacin与aspirin 、taurocholic acid致溃疡机制不同，而且morphine是通过增加粘液屏障的厚度来发挥抗溃疡作用的，且增加的厚度值与它的保护效应正相关，其保护效应能被naloxone逆转。由此可见，mu-阿片受体在胃组织各功能细胞的分布决定了它的生理功能，并与细胞的所处的功能状态有关。

本研究发现delta-与kappa-阿片受体在胃黏膜上皮及黏液层没有阳性颗粒的表达，只分布于胃主细胞、肌间神经丛这些区域。delta-与kappa-阿片受体对胃肠道功能影响的研究尚不多见，Gyires K等[1]人2001年研究了δ阿片受体选择性激动剂DADLE、DPDPE、deltorphin II和mu-受体选择性激动剂DAGO对乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤的保护作用，其结果发现外周delta-和mu-阿片受体介导胃粘膜保护，阿片受体胃粘膜保护作用需要迷走神经完整性，NO和PGs参与了阿片受体介导的胃保护。我们的前期研究结果也表明，舒芬太尼可通过抗氧自由基机制对大鼠急性胃黏膜病变发生保护作用，其可能与delta-、kappa-阿片受体有关[7]。delta-与kappa-阿片受体在胃肠道中的生理功能及相互之间的作用需进一步深入研究。

在本实验中值得注意的是，mu-、delta-、kappa-三种阿片受体在黏膜下神经丛为阴性表达。黏膜下神经丛支配黏膜下血管，而黏膜下血管的收缩影响胃黏膜血流量(GMBF)，而GMBF是胃黏膜保护与损伤重要的调控靶点之一。近年来，本研究领域鲜有阿片类药物对GMBF影响的文献报道，从本实验结果似乎可以看出mu-、delta-、kappa-三种阿片受体对GMBF没有直接影响，它们可能通过对组织局部NO和PGs含量的影响来间接调节GMBF，但阿片肽对NO和PGs组织含量的影响机制尚不明了。

总之，mu-、kappa-、delta-阿片受体在胃主细胞膜和胞浆、肌间神经丛等部位均有分布，但仅mu-阿片受体存在于胃黏膜上皮及黏液层，提示阿片受体参与了胃各种生物学功能及胃粘膜的损伤、修复与再生，其确切机制尚有待于进一步研究。

[1] Gyires K, Ronal AK.Supraspinal δ- and μ-Opioid Receptors Mediate Gastric Mucosal Protection in the Rat[J].J Pharmacol Exp Ther,2001,297(3):1 010-1 015.

[2] Del Tacca M,Bernardini C,Corsano E,et al.Effects of morphine on gastric ulceration, barrier mucus, and acid secretion in pylorus-ligated rats[J].Pharmacology,1987,35(3):174-180.

[3] Tazi-Saad K,Chariot J,Vatier J,et al.Antisecretory andanti-ulcer effects of morphine in rats after gastric mucosal aggression[J].Eur J Pharmacol,1991,192(2):271-277.

[4] Bhounsule SA, D′Souza RS, Dhume VG. Gastric cytoprotective effect of morphine is probably not mediated by mu-receptors[J].Arch Int Pharmacodyn Ther,1994,328(1):99-105.

[5] 黎家华，石新兰，唐英卿.多个免疫组化指标检测效果的方法探讨[J].湖北民族学院学报(医学版)，2002，19(2)：58-59.

[6] Gyires K, Rónai AZ,Tóth G, te al. Analysis of the role of delta opioid receptors in gastroprotection in the rat[J].Life Sci,1997,60(16):1 337-1 347.

[7] 李成龙, 屠伟峰,丁东.舒芬太尼预处理对大鼠急性胃黏膜病变组织中MDA与SOD的影响[J].广东医学,2008,29(9):1 463-1 465.