白质消融性白质脑病患儿12例临床与遗传学研究

冷雪荣 吴 晔 潘艳霞 杜 丽 金 洪 王静敏 姜玉武

白质消融性白质脑病(leukoencephalopathy with vanish-ing white matter，VWM)是一种常染色体隐性遗传的白质脑病，是儿童期常见的遗传性白质脑病之一[1]。VWM是由编码真核细胞翻译启动因子2B(eukaryotic translation initiation factor 2B，eIF2B)的5个亚单位(eIF2Bα、β、γ、δ、ε)的相应编码基因EIF2B1～5的任一突变引起[2]。eIF2B为5个亚单位构成的五聚体复合物，其中eIF2Bε是重要的亚单位，具有鸟苷酸转移因子(guanine nucleotide-exchange factor, GEF)活性，直接作用对象为真核细胞翻译启动因子2 (eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2)，催化eIF2-GDP向eIF2-GTP转化；其他4个eIF2B亚单位在调控GEF活性方面具有重要作用。

目前，VWM临床诊断主要依据典型的临床表现以及头颅MRI特点，确诊需经基因突变分析。本研究对临床诊断并经基因突变分析确诊的中国VWM患儿进行临床特征总结，对基因突变特点进行分析，并做初步的突变功能研究。以期提高儿科医生对该病的认识，并为进一步的遗传咨询及了解VWM发病机制打下基础。

1 对象与方法

1.1 诊断标准 VWM依据van der Knaap等推荐的标准[3]：①早期的精神、运动发育基本正常或轻度落后；②儿童早期出现进行性加重的神经系统功能倒退，发热或轻微头部外伤均引起病情加重；③神经系统症状主要包括小脑共济失调，肢体痉挛；④头颅MRI表现为弥漫性、对称性大脑白质广泛受累，累及中央区及皮质下白质，白质异常在T1、T2及FLAIR像上逐渐演变为与脑脊液相同的信号。

1.2 纳入标准 以临床诊断为VWM的患儿为研究对象。

1.3 排除标准 ①常见有机酸、氨基酸、脂肪酸和线粒体代谢病；②已知常见的其他遗传性白质脑病；③后天获得性白质病变(脑室旁白质软化和急性播散性脑脊髓炎等)。

1.4 伦理审核 本研究方案经北京大学第一医院临床研究伦理委员会审批，所有患儿家属均签署知情同意书。

1.5 临床资料收集 包括：病史及体格检查；血生化(电解质、血氨、乳酸、丙酮酸及肝、肾功能)检查；尿有机酸、氨基酸及脂肪酸分析结果；白细胞芳香硫脂酶A和β半乳糖脑苷脂酶活性测定结果；头颅MRI片。

1.6 基因突变分析

1.6.1 提取外周血白细胞DNA 采集患儿及其父母外周静脉血各5 mL，抗凝，以常规盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。

1.6.2 突变筛查 国际上报道VWM的120多种突变中[4]，EIF2B5突变最为常见，占57%。EIF2B2突变占15%，EIF2B4突变占17%，EIF2B3突变占7%，EIF2B1突变仅占4%[5，6]。因此，对于每例患儿首先筛查EIF2B5突变，随后依次筛查EIF2B4、EIF2B2、EIF2B3和EIF2B1突变。PCR扩增包括EIF2B5的16 个外显子,EIF2B4的13个外显子，EIF2B2的8个外显子，EIF2B3的12个外显子，EIF2B1的9个外显子，以及所有外显子-内含子交界区。扩增产物经PAGE检测，在ABI 3100 测序仪上直接正反向测序，测序结果使用DNASTAR 软件分析。对于本研究发现的国外未报道的新突变，通过分析氨基酸变化、保守性、家系传递分离分析、已知基因多态性数据库检索及100例健康成人对照的测序，以确定所发现的突变为致病突变，排除基因多态性。并对其父母进行基因测序，分析突变来源。

1.7EIF2B5突变功能研究

1.7.1 突变的选择 选择在患儿中发现的EIF2B5基因的新突变进行功能研究。

1.7.2 质粒构建 将带有野生型人类eIF2Bε全长cDNA的 PHM表达质粒(加拿大Southampton大学Proud教授馈赠)，利用QuikChange Site-directed Mutagenesis 试剂盒(Stratagene公司)进行定点突变，获得突变体质粒。N端具有 Hexahistidine (His6)和 Myc标记，以便于检测蛋白表达。所有的cDNA均经测序验证。

1.7.3 培养和转染HEK 293细胞 将HEK 293细胞接种于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中，在37℃和5%CO2条件下孵育。每2 天换液1次。利用lipofecta-mine2000试剂盒(Invitrogen公司)进行细胞转染，分别转染野生型及突变型质粒，48 h后提取细胞总蛋白。

1.7.4 提取蛋白 用冰冷的PBS洗细胞2次，将细胞裂解液(50 mmol·L-1Tris HCl，50 mmol·L-1beta-glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate，1 mmol·L-1EDT，1 mmol·L-1EGTA，1% Triton X-100)直接加入细胞中，吹打细胞，使细胞完全裂解。分别将细胞裂解液转移至EP管，4℃，13 000 r·min-1离心10 min。吸取上清蛋白，-80℃保存。

1.7.5 Western blot分析突变蛋白表达 将蛋白标本加入等体积2× SDS sample buffer，95℃加热5 min。在8% SDS-PAGE分离，每条泳道蛋白上样量20 μg，每次电泳包括野生型和突变型的蛋白标本。电泳结束后，用湿转法电转蛋白至硝酸纤维素(NC)膜上。转移后的NC 膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(Anti-myc，Sigma公司)，4℃过夜。用TTBS 洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗(山羊抗兔IgG，北京中山生物技术公司)，室温孵育1 h，TTBS 充分洗膜，通过鲁米诺化学发光法暴光Kodak 胶片，显示目的条带。以β-actin作为内参，同一组的目的条带灰度与β-actin相比，计算相应比值，进行半定量分析。

2 结果

2.1 一般资料 2006至2008年于北京大学第一医院儿科神经科临床诊断为VWM患儿12例，其中男8例，女4例。临床及头颅MRI表现符合VWM的临床诊断标准。父母均非近亲婚配，患儿间无亲缘关系。临床特征见表1。

2.3 辅助检查特点 头颅MRI均呈典型改变：弥漫性、对称性大脑白质受累，以中央区白质为著，在T1加权像、T2加权像及FLAIR像，受累白质表现为接近或等于脑脊液信号(图1)。所有患儿其他辅助检查均未见明显异常。

图1 VWM患儿(例1)的头颅MRI片

Fig 1 Brain MRI from patient 1 with VWM

Notes A:T2-weighted;B:T1-weighted;C:FLAIR;Symmetric and diffuse signal abnormalities in periventricular and subcortical white matter were shown, with low signals in T1-weighted image and FLAIR image, and high signals in T2-weighted image, similar to that of cerebrospinal fluid

2.4 基因突变分析 12例患儿中发现16种基因突变。其中6例患儿为EIF2B5突变，5例为EIF2B3突变，1例为EIF2B2突变。16种基因突变中包括9种国际上未报道的新突变和7种已知突变。7种已报道的突变为EIF2B5：c.943C>T (p.R315C)、c.1340C>T(p.S447L)、c.1016G>C(p.R339P)、c.1157G>T(p.G386V)、c.337C>T(p.R113C)、c.806G>A(p.R269Q)；EIF2B3：c.674G>A(p.R225Q)。9种新突变中7种错义突变为EIF2B5：c.185A>T(p.D62V)、c.1004G>C(p.C335S)、c.1126A>G(p.N376D)；EIF2B3：c.140G>A(p.G47E)、c.1037T>C(p.I346T)；EIF2B2：c.254T>A(p.V85E)、c.922G>A(p.V308M)； 1种无义突变为EIF2B5： c.805C>T(R269X)；1种缺失突变为EIF2B5：c.1827-1838del(p.S610-D613del)(表1，图2)。9种新突变均位于进化上的高度保守区，未在100例健康成人对照中发现。1例患儿(例10)仅在一个等位基因上发现了突变，另一个等位基因的编码区以及外显子-内含子交界区未发现突变。所有患儿的突变均来自表型正常的父母。

图2 9种EIF2B新突变的测序图谱

Fig 2 The chromatograms of sequencing results of 9 novelEIF2Bmutations

Notes A:EIF2B3，c.140G>A, p.G47E ;B:EIF2B3，c.1037T>C, p.I346T (reverse sequencing);C:EIF2B5，c.1126A>G, p.N376D；D:EIF2B5,c.1004G>C, p.C335S;E:EIF2B5,c.805C>T, p.R269X(reverse sequencing);F:EIF2B5,c.185A>T, p.D62V;G:EIF2B5,c.1827-1838del,p.S610-D613;H:EIF2B2,c.254T>A,p.V85G;I:EIF2B2,c.922G>A,p.V308M

2.5EIF2B5突变功能研究EIF2B5新突变p.D62V、p.R269X、p.C335S、p.N376D和p.S610-D613del 中，p.R296X和p.S610-D613del突变引起蛋白表达量显著降低，Western blot几乎检测不到条带(图3)。其他3个错义突变p.D62V、p.C335S和p.N376D蛋白表达量与野生型差异无统计学意义。

图3 5种EIF2B5突变对eIF2Bε蛋白表达量的影响

Fig 3 Effects of fiveEIF2B5 mutations on the mutant eIF2Bε protein expression

Notes HEK 293 cells were transfected with wild-type or mutant eIF2Bε cDNA, lysates were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylam gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. On immunoblots, eIF2Bε-p.D62V, eIF2Bε-p.C335S and eIF2Bε-p.N376D were present in amounts similar to the wild type, whereas eIF2Bε-R269X and eIF2Bε-S610-D613Sdel were present in a substantially reduced amount, which almost could not be detected

3 讨论

VWM是儿童期起病的遗传性白质脑病中常见的类型之一。VWM临床表型差异很大，起病年龄可早至胎儿期(先天型，1岁内死亡)或晚至成年期(成年型)，其中以1～5岁起病最为多见(早期儿童型，又称经典型)。早期儿童型VWM患儿发病前智力和运动发育多正常，少数有轻度运动或语言发育落后。起病表现多为共济失调，逐渐出现肢体痉挛、构音障碍和惊厥，在病程后期可出现吞咽困难，智力受累相对较轻。临床特征性表现为遇轻微感染(如上呼吸道感染)所致发热或轻微头部外伤后即可引起病情明显加重，出现运动功能丧失，可伴易激惹、呕吐、意识障碍，甚至惊厥及昏迷，病程中可逐渐缓慢恢复，发作也可导致死亡。VWM患儿的病程变化个体差异较大，多于起病后数年内死亡，也有存活数十年的报道[7]。本组12例患儿根据起病年龄均属于早期儿童型。至末次随访，病程为9个月至7年，所有患儿均存活。本病典型体征主要为锥体束征阳性，可伴有共济失调体征，头围多正常。本病头颅MRI具有较独特的特征，大脑白质病变显著重于其他遗传性白质脑病，表现为弥漫性、对称性大脑白质的液化样改变，即“白质消融”，以中央区白质受累为著，逐渐波及全部大脑白质。小脑白质也可出现异常信号，但通常不发生液化。本组12例VWM患儿均具有上述典型头颅MRI特征。

VWM是第1个被确定的因mRNA翻译启动异常所导致的人类遗传疾病，其致病基因在2001至2002年被确定是由elF2B的5个亚单位(elF2Bα、β、γ、δ、ε)的相应编码基因EIF2B1～5的任一基因突变引起。临床诊断为VWM的患者95%存在EIF2B1～5基因突变。目前关于VWM的研究对象多为白种人，65%的VWM患者为EIF2B5基因突变所致。EIF2B5基因的错义突变R113H被认为是一热点突变，可能发生于近40%的VWM患者中[5,7～9]。在所有已发现的EIF2B1～5突变中，以错义突变为主，无义突变很少[6]。目前确诊的VWM患者中，携无义突变患者多为无义加错义的复合杂合子，而非纯合无义突变，提示该基因功能非常重要，携无义突变纯合子患者可能不能存活[2]。目前尚无确定的基因型-表型相关性。在本组VWM患儿中，EIF2B突变谱与既往报道存在差异，在16种突变中9种为既往未报道的新突变。突变仅发生在EIF2B5，EIF2B3和EIF2B2上，其中EIF2B5突变占68.8%(11/16)；EIF2B3突变占18.8%(3/16)，高于国外报道的7%[5，6]。5/12例患儿携带EIF2B3突变。提示中国VWM患儿EIF2B3突变率可能较高。本研究还发现了EIF2B3的一个热点突变p.I346T，5例携带EIF2B3突变的患儿中，有4例携带此突变。既往报道的EIF2B5热点突变p.R113H在本组VWM患儿中未被发现。因此初步推测中国 VWM患儿可能具有其独特的EIF2B基因突变谱，与VWM白种人患者的EIF2B突变谱有所不同。但基于本研究样本量较小，尚需累积更多患儿的基因突变分析结果进一步证实。

elF2B突变导致VWM的发病机制目前尚不十分清楚[10～13]。在真核细胞蛋白翻译启动时，elF2-GTP负责将Met-tRNA结合至40S核糖体亚单位上，识别并结合mRNA上相应的起始密码AUG从而启动翻译过程，随即 elF2-GTP脱磷酸为eIF2-GDP而失去活性。elF2B具有GEF活性，负责eIF2的GDP/GTP转化，使elF2-GDP再次转化为具有活性的elF2-GTP，投入下一轮蛋白质翻译启动过程[14]。eIF2Bε是最重要的eIF2B亚单位，由721个氨基酸组成，其C末端的第518～712位氨基酸残基与底物eIF2结合，发挥其GEF活性。N末端500个氨基酸是与其他亚基结合的作用区域，可能影响亚单位之间的结合[14]。eIF2Bε突变可能通过不同途径影响蛋白功能从而致病，包括影响蛋白表达量、五聚体形成、eIF2B与底物结合等多种途径。本研究初步结果显示，p.R296X和 p.S610-D613del突变导致eIF2Bε蛋白表达量显著下降，因此不能生成足够具有功能的eIF2B复合体，为严重影响功能的突变。p.R296X和 p.S610-D613del突变均发生在复合杂合子中，推测如为突变纯合体，因严重缺乏有功能的eIF2Bε蛋白，患儿可能无法存活。

本研究首次对中国VWM患儿进行了eIF2B各亚单位的基因突变筛查，并发现了国际上未报道的9种新突变，且初步揭示中国 VWM患儿可能具有与白种人群不同的基因突变谱。目前初步的功能研究结果提示，eIF2Bε的两种新突变p.R296X及 p.S610-D613del可导致蛋白表达量显著下降，提示其严重影响eIF2Bε蛋白功能。为进一步探讨VWM基因型和表型的关系以及VWM的发病机制，本课题组正在继续收集病例，并进行下一步的突变功能研究。

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