利用分子标记辅助选育抗条纹叶枯病粳稻新品系

何冲霄 董晓鸣 姚立生 孙明法 梁国华

(1.盐城市农业科学研究院，江苏 盐城 224002；2，盐城生物工程高等学校，江苏 盐城 224002；3.扬州大学农学院，江苏 扬州 225009)

水稻条纹叶枯病是当前江苏等地区水稻生产上最严重的病害之一，对粮食安全和农民收入造成极大影响[1，2]。采用农业防治和化学药剂等方法对水稻条纹叶枯病的控制效果有限，在重发地区，并不能阻止条纹叶枯病的持续流行，选育抗病品种才是从根本上控制水稻条纹叶枯病危害的主要途径[3]，目前在生产上使用的抗病品种一般也表现较好抗性，但产量、米质方面存在或多或少的缺陷。所以培育既抗水稻条纹叶枯病又优质高产的品种成为当前防治水稻条纹叶枯病的首要任务。但是通过传统的育种方法要想选育抗性好、米质优、产量高等集多个育种目标于一体的品种需要很长的育种年限。水稻条纹叶枯病抗性是由Stv-bi控制的，且已在第11染色体上精确定位，其连锁标记在育种群体的亲本之间具有多态性[4-7]。这使得抗水稻条纹叶枯病基因的分子标记辅助育种成为可能，目前这方面的报道较少见。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供体亲本：盐稻8号，含抗水稻条纹叶枯病基因，米质一般，产量潜力有限。

轮回亲本：盐稻9号，高产、优质、不抗水稻条纹叶病。

亲本和各世代中间材料见表1。

表1 亲本和各世代中间材料

1.2 抗性基因的分子检测

DNA提取：在苗期各待测单株检测分别挂牌编号，每株剪取幼叶7～8左右，用小量法(见附录1)提取单株DNA,待测品系的检测是每小区随机取10株检测。

分子标记检测：本研究中应用的是与Stv-bi紧密连锁的STS标记，其引物的设计及STS分析均在扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室由梁国华教授指导完成。

PCR扩增反应体系包括：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、1.5U的Taq酶、4nmol dNTP、10pmol引物、20ng模板DNA。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，50～60℃退火1min，72℃延伸1.5min，32个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物上样于含EB(溴化乙锭)的3%琼脂糖凝胶，以120V电泳2h，于紫外灯和BIORAD凝胶成像仪下观察、读数。

1.3 条纹叶枯病抗性鉴定

田间自然接种鉴定：选水稻条纹叶枯病重病区(盐城建湖)做试验田，从播种到成熟作不治虫处理，利用田间的带毒灰飞虱进行自然接种水稻条纹叶枯病毒，让其自然发病。待病情发展稳定之后，调查发病情况，本研究采用了两个抗病性鉴定标准：一是株系发病率，即发生病症的株数与总株数之比；二是病级指数，参照Washio的抗性鉴定标准得出数据[8-10]。

分子标记检测鉴定：根据各回交世代分子标记检测结果，决定下一代回交的母本单株，最后各品系的检测结果与田间自然抗性结果对比，最终判断各品系的抗性。

2 结果与分析

2.1 抗水稻条纹叶枯病粳稻新品系的选育

用抗水稻条纹叶枯病品种盐稻8号改良不抗病，但高产、优质的盐稻9号，自2005年夏的杂交配组开始，历经三年6代的杂交、回交及人工选择和分子标记辅助选择，于2008年夏初步育成近似于盐稻9号的抗水稻条纹叶枯病粳稻新品系21个，世代为BC3F3。其中有5个品系田间对条纹叶枯病有较好抗性、产量及综合农艺性状比较理想，分别编为GK1、GK2、GK3、GK5、GK6，如图1。

2005年盐城盐稻8号×盐稻9号盐稻8号为供体亲本,盐稻9号亲本,得杂交种112粒。↓2005年三亚F1×盐稻9号杂种F1成苗33株,其中有8株为杂种,选一分蘖强的真杂交种与盐稻9号杂交得杂种53粒。↓2006年盐城BC1F1×盐稻9号杂种成苗23株,经分子检测有5株含Stv-bi基因,5株中选编号为06GC1019号单株与盐稻9号杂交得杂交种87粒。↓2006年三亚BC2F1×盐稻9号杂种成苗28株,经分子检测有7株含Stv-bi基因,7株中选编号为06HG012号单株与盐稻9号杂交得杂交种34粒。↓2007年盐城BC3F1成苗19株,经分子检测有7株含Stv-bi基因,7株全部自交得7个株系种。田间编号为07G01、07G02、07G05、07G06、07G08、07G09、07G10。↓2007年三亚BC3F2上代当选的7个株系每个株系种植400株,田间号分别为07HGF201、07HGF202、07HGF203、07HGF204、07HGF205、07HGF206、07HGF207。根据田间长势淘汰了受低温危害结实率偏低的4个株系,在株系田间号为:07HGF201、07HGF202、07HGF204的3个保留株系中分别选单株7个共计21个单株。↓2008年盐城BC3F3当选的21个单株分别种成21个小区,每小区4m宽1.3m。栽插规格20cm×20cm。

图1抗水稻条纹叶枯病粳稻新品系的选育过程

2.3 各品系的抗性鉴定

2.3.1大田自然接种鉴定。对同等条件下种植的21个品系进行水稻条纹叶枯病田间抗性调查，结果表明21个品系分属上代的3个株系，其中GK1-7是07HGF21的后代，其抗性表现最好，除GK7是中抗外(分离)，其它6个均抗。另两个株系07HGF22和07HGF24的后代中仅有一个品系是抗，其余均为感，见表2。

表2 2008年正季亲本和个品系大田自然接种后对RSV的抗性表现

注：“*”表示当选品系，R为抗、MR为中抗、S为感病。

2.3.2分子标记检测抗性。21个品系对不同引物的检测结果并不完全一致，根据21个品系对6个引物的检测汇总如表3，并选了其中的两个电泳图以供参考如图2、3。表2、3显示，GK1-GK7的7个品系(上代为07HGF21)与6个引物检测，取得几乎一致的结果，GK1-GK6全抗，GK7为分离(A29除外)。GK8-GK14的7个品系(上代为07HGF22)略有不同，其中GK8、GK9、GK12三个品系对不同引物检测结果稍有不同。GK15-GK217个品系(上代为07HGF24)的检测结果仅有GK15、GK20取得相同的结果，其它5个品系检测结果都不一致。6个引物中A38与A36对所有品系的检测结果完全一致，并且这个结果与大田自然抗性鉴定的结果相似程度最高，仅GK8和GK19不同，见图2、表2。引物ZHSTS11-43与大田发病情况差别最大有6个品系的田间抗性与之不符，见表2、3。引物A31、A40分别有三个与大田不符，A29数据缺失过多无参考价值。

表3 21个粳稻新品系STS检测结果

注：“0、1、2、3”分别表示数据缺失、感病、分离、抗病

P1P2 K1K21图2 P1为抗病对照盐稻8号,P2为感病对照盐稻9号,标记为A36(STS标记)

P1P2 K1K21图3 P1为抗病对照盐稻8号,P2为感病对照盐稻9号,标记为ZHSTS11-43(STS标记)

2.4 当选5个品系农艺性状与盐稻9号的比较

从苗期开始性状观察。将当选的21个品系与轮回亲本(种植在同等肥力条件和相同栽培管理的试验田中)作比较，总的看来，21个品系的田间表现明显可分成三个大类每类7个，它们分别属于上代的三个不同群体(见表2)。在苗期至分蘖盛期各株系与亲本的表现差别不明显;分蘖盛期之后各品系逐渐表现出与亲本的差异，GK1-7株高明显高于亲本，抽穗期迟于亲本3d，GK8-14株高与亲本相似，抽穗期与亲本相近，GK15-21株高比亲本偏矮，抽穗期早3d左右。三个大类中差别较小，仅在株高和生育期，及芒的有无等方面有所不同。各品系内差别更小，但GK7品系内性状尚有分离。

5个抗病品系农艺性状与盐稻9号室内考种结果的比较结果列于表4。轮回亲本盐稻9号因发病影响了产量，但株高和分蘖性及生育期等性状仍比当选品系有优势。

表4 当选的5个抗病品系农艺性状与盐稻9号室内考种结果的比较

3 讨论

用分子标记辅助选择方法培育抗病品种是既高效又经济的手段，它不受环境条件的影响，借助紧密连锁的分子标记可以在植物生长的任何阶段对抗性基因进行鉴定和选择，而分析手段快速简便，提高了选择的效率，加快了育种进程。研究所用的分子标记准确可靠、操作方便，有很高的使用价值。个别数据与大田发病有出入可能是群体基因尚未纯合一致导致的取样误差。

本研究用分子标记辅助选择方法初步选育出了与亲本相似，而抗性明显优于轮回亲本的5个粳稻品系，说明利用分子标记辅助选育抗水稻条纹叶枯病粳稻新品系的方法是可行的。但是当选的5个品系虽然经历了三年六代的单株系选，基本达到了集高产、优质、抗病于一体的目标。但各品系间、品系内尚有分离，差别较大的亲本存在多对基因的差异，为我们进一步筛选抗病的纯合品系，提供了丰富的基础材料。

[1] 杨荣明,刁春友,朱叶芹,等.江苏省条纹叶枯病上升原因及防治对策[J].植保技术与推广,2002,22(3):9-12

[2]马学文,陈思宏,王兆伦,等.洪泽县大面积发生水稻条纹叶枯病[J].植物保护,2001,27(4):52

[3] 林奇英,谢联辉,周仲驹,等.水稻条纹叶枯病的研究I病害的分布和损失[J].福建农学院学报,1990,19(4):421-425

[4]丁秀兰,江玲,刘世家,等.利用重组自交系群体检测水稻条纹叶枯病抗性基因及QTL分析[J].遗传学报,2004,31(3):287-292

[5] 邢祖颐.籼粳稻杂交育种的研究II,抗条纹叶枯病育种[J].作物学报,1985,11(5):1-7

[6] Washio O, Ezuka A, Sakurai Y, et al.Testing method for, genetics of and breeding for resistance to rice stripe disease[J].Bull Chugoku Natl Agric Exp Stn A,1968,16 : 39-197

[7]Hayano-Saito Y, Saito K, Fujii K, et al.Linkage analysis of the resistance gene to rice stripe disease[J].Japan.J.Breed.1993,43: 85

[8]丁秀兰,江玲,刘世家,等.利用重组自交系群体检测水稻条纹叶枯病抗性基因及QTL分析[J].遗传学报,2004,31(3):287-292

[9] Washio O,Ezuka A,Sakurai Y,et al.Studies on the breeding of rice varieties resistant to ricestripe disease I:Varietal difference in resistance to stripe disease[J].Japn J Breed,1967,17:91-98

[10]高东明,秦文胜.抗性品种对预防水稻条纹叶枯病发生和流行的研究[J].浙江农业学报,1994,6(3):14-149