凝胶色谱法测定保健食品中免疫球蛋白IgG

宋戈，郝岩平，姜金斗

（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 150086）

凝胶色谱法测定保健食品中免疫球蛋白IgG

宋戈，郝岩平，姜金斗

（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 150086）

建立了凝胶色谱法测定保健食品中免疫球蛋白IgG含量的方法。采用紫外检测器，测定波长280 nm；色谱柱为ZorbaxGF-250，柱温为20℃，流动相为0.01 mol/L KH2PO4+0.1 mol/L K2HPO4+0.15 mol/LNa2SO4（pH 6.0）,流速为1.0 ml/min；样品调pH值为4.6沉淀酪蛋白及变性乳清蛋白后过滤分离。本方法的最低检测限为1 mg/g，标准曲线的相关系数为0.9999，回收率在97.2%～103.2%，RSD为1.38%。

凝胶色谱；免疫球蛋白；保健食品

0 引 言

近年来,对富含IgG的牛初乳用做食品的添加剂的研究成为热点。将IgG添加到婴幼儿配方奶粉、保健食品中,对于改善婴幼儿、中老年人及免疫力低下的人群的健康有重要意义。因此，需要建立简单、快速、准确检测保健食品中IgG的方法。常用的测定牛初乳制品中IgG的方法有琼脂双向免疫扩散法[1]、酶联免疫双抗体夹心法[2]、化学发光自显影法[3]和毛细管电泳法[4]等。这些方法操作复杂、重复性差且耗时，成本高。我国国家标准方法[5]采用的是高效亲和色谱法，该法分析时间较长,而且不适用于大量常规样品的测定。而目前高效液相色谱法[6，7]达不到测定的分离要求，有待进一步不完善。

本文对凝胶色谱法测定免疫球蛋白IgG进行了研究,建立了测定保健食品中免疫球蛋白IgG的方法，并通过对市售的保健食品样品中的免疫球蛋白IgG的检测论证该方法的可行性。

1 实 验

1.1 仪器设备

Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器，酸度计，磁力搅拌器。

1.2 试剂

磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠、硫酸钠、磷酸等均为分析纯 （AR.）；IgG标准品（≥95%）；含IgG片剂、粉剂、胶囊及牛初乳。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Zorbax GF-250柱，4 μm×9.4 mm×250 mm，柱温20℃，测定波长280 nm，流动相为0.01 mol/L KH2PO4+0.1 mol/L K2HPO4+0.15 mol/L Na2SO4（pH=6.0）[8],流速为1.0 mL/min。

1.3.2 样品处理

液体样品直接吸取20 mL移入150 mL三角瓶中称量；固体样品应先研碎 （不能用粉碎机粉碎）称量0.5000 g移入三角瓶中，加入40℃左右水20 mL，用磁力搅拌器搅拌溶解样品。用酸度计精确调pH值至4.6后，将样品洗入漏斗中过滤，用50 mL容量瓶收集滤液，用蒸馏水定容，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤,供分析测定。

1.3.3 定量测定

标样与样品测定的叠加色谱如图1所示。

图1 标样与样品测定的叠加色谱

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

通过对不同流动相的试验研究，在满足分离效果，达到待测组分与杂质基本分离的条件下，选择了能改善待测组分响应，提高灵敏度的流动相。

2.2 样品的处理

由于免疫球蛋白受热后极易变性，在74℃（15 s）就遭到破坏，从而失去活性，所以溶解固体样品的水不能超过74℃。由于粉碎机粉碎样品是会产生高温，能导致免疫球蛋白变性，所以用研钵将样品研碎。经过比对试验，将样品溶液的pH调至4.6除出酪蛋白及变性乳清蛋白后，不影响所测得的结果，为了进一步除出杂质和延长色谱柱的寿命，所以对样品溶液进行了调pH。片剂、粉剂及胶囊等保健食品中脂肪含量很少，即使是牛初乳，经过调pH值除蛋白，纸过滤后，残留的脂肪很少，不会影响免疫球蛋白测定，从而不用高速离心除出脂肪，就能分析测定，可以大大提高工作效率。

2.3 标准曲线与线性相关系数

分别配置不同质量浓度的标准样品溶液，依次进样10 μL测定，结果如表1所示；绘制标准曲线结果如图2所示，其相关系数为r=0.9999。

表1 标准曲线数据

2.4 回收率实验

以同一个样品实验材料，加入质量浓度为1g/L的IgG标准溶液5 mL,然后进行样品处理，分析测定，结果如表2所示。由表2可以看出，回收率在97.2%～103.2%之间。

图2 标准曲线

表2 回收率实验结果

2.5 精密度实验

对同一个样品，进行了7次检测，结果如表3所示。由表3可以看出，测定结果的重现性较好，相对标准偏差为1.38%，测定结果较为稳定。

表3 精密度实验g/100g

2.6 检出限

取标准样品溶液进行测定，以3倍的基线噪声为峰高计算。本方法的检出限为1 mg/g，完全满足保健食品中免疫球蛋白IgG测定。

2.7 样品测定结果

分别对含有IgG的（片剂、粉剂及胶囊）保健品样品进行了检测。测定结果如表4所示,测量值与产品标示值基本吻合。

表4 保健食品中免疫球蛋白IgG质量分数的测定结果g/100g

3 结 论

本文确定了提高检测免疫球蛋白IgG灵敏度的流动相，重点研究了样品处理免疫球蛋白IgG测定的影响，建立了凝胶色谱法测定保健食品中免疫球蛋白IgG的方法，该方法测定结果重现性好，准确度高，简单易操作，是测定保健食品中免疫球蛋白IgG较好的方法。

[1]吴继尧,刘鹏龙,张丹凤，等.琼脂双向免疫扩散法测定牛初乳中IgG[J].新疆农业科技,2001,38（5）：252-254.

[2]项新华,尹香君,赵丹慧，等.酶联免疫双抗体夹心法检测牛初乳素中免疫球蛋白IgG[J].中国卫生检验杂志,2002,12（2）：137-138.

[3]刘翼珑,乔惠理,邓泽沛.测定牛IgG的化学发光自显影法的建立[J].中国免疫学杂志,1998，258（1）：187.

[4]王茜,丁晓静,王心宇，等.毛细管电泳法快速测定保健食品中免疫球蛋白G[J].分析化学,2006,34（8）：1161-1164.

[5]GB/T5009,194-2003保健食品中免疫球蛋白IgG的测定[M].北京：中国标准出版社,2004.

[6]马燕芬,陈志伟,魏晓兵，等.高效液相色谱法测定牛初乳中IgG含量的方法研究[J].饲料工业,2007,28（5）：33-38.

[7]熊勇华,许杨,魏华，等.HPLC法检测牛初乳中IgG含量[J].食品工业科学,2003（9）：80-82.

[8]Dried Milk Assessment of Heat Treatment Intensity High Performance Liquid Chromatographic Method[S].IDF Standard，1992：162.

Determination method of IgG in health foods by GFC

SONG Ge，HAO Yan-pin，JIANG Jin-dou
（Northeast Agriculture University National Dairy Testing Center,Harbin 150086,China）

A method for determination of IgG in dairy by GFC is reported.ultraviolet detector,testing wavelength 280nm,GF-250 column was used with column temperature 20℃.Mobile phase 0.01mol/L KH2PO4+0.1 mol/L K2HPO4+0.15mol/L Na2SO4（pH 6.0）.The speed of mobile phase was 1.0ml/min.Sample deposit casein and metamorphic whey by pH 4.6.The minimum detectable value was 1mg/g.The relative coefficient was 0.9999.The recovery ranged from 97.2%～103.2%.The relative standard deviations（RSD）was 1.38%.

GFC；IgG；health foods

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0055-02

2009-07-17

宋戈（1982-），男，助理工程师，从事乳制品检测与研究。