乳品中有害微生物的检测技术和发展方向

张守文，尹蕾，周玉玲

（1.黑龙江省食品药品监督管理局，哈尔滨 150020；2.哈尔滨商业大学食品学院，哈尔滨 150076）

乳品中有害微生物的检测技术和发展方向

张守文1，尹蕾2，周玉玲2

（1.黑龙江省食品药品监督管理局，哈尔滨 150020；2.哈尔滨商业大学食品学院，哈尔滨 150076）

从食品安全的角度出发，系统地介绍了乳品中主要高危害致病菌及其危害、检测方法的历史进程、当前国内外乳中有害微生物的检测方法、乳中微生物检测技术的发展方向。

乳品，微生物，检测技术，发展方向

0 引 言

近年来，乳品安全事件频繁发生，其中大部分是由于污染致病菌引起的大规模乳品中毒事件。2008年，珠海、江门两市多家幼儿园发生饮用乳制品中毒事件[1]，后经调查该批牛奶中含有大量金黄色葡萄球菌。这一事件再次使乳品安全问题成为社会各界关注的焦点。

乳以安为重。有害菌的快速检验和有效鉴定对乳品的质量和安全有着重要意义。目前，常规的乳品检测手段有微生物法、理化法和免疫法等，随着分子生物学技术的发展，PCR技术、基因芯片、流式细胞技术等技术也被用于乳品中微生物的检测鉴定。本文综述了乳品中有害致病菌的检测技术及其发展动态和趋势。

1 乳中主要有害微生物及其危害

乳品中常见病原菌检测品种有：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森式菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌、耶尔森氏菌、空肠弯曲菌等，包括阪崎肠杆菌。这些致病菌可引起人类剧烈呕吐、腹泻、虚脱、急性胃肠炎等，甚至危及生命。2002年，美国FDA在某一国际乳业巨头公司生产的婴幼儿配方奶粉中新检出了一种致病菌——阪崎肠杆菌，可以引发婴儿、尤其早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和爆发，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。2003年又一家国际公司主动召回了一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，阪崎肠杆菌从此成为世界乳业瞩目的焦点。2008年，我国国家质检总局公布了味全奶粉、澳优乳品均被检验出含有致病菌阪崎肠杆菌。联合国粮农组织和世界卫生组织经过风险性评估，将阪崎肠杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方奶粉A类致病菌。

2 检测方法的历史进程

通常检测食物病原体有多种方法，17世纪中叶荷兰人吕文虎克用自制的简单显微镜观察并发现了许多微生物。Widal[2]于1896年利用伤寒病人血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象成功地诊断伤寒病，这便是免疫学方法的初步运用。18世纪，体液酶的分析通过碱性磷酸酶检测肝功能；血清淀粉酶检测胰腺炎；酶类标志物检测心脏病；19世纪，放射及酶联免疫分析激素检测内分泌功能；肿瘤标志物检测癌症；蛋白标志物检测心脏病；到了20世纪，生化检测方法检测糖尿病、心血管病等；21世纪，应用分子生物学，通过实时定量PCR分子诊断仪实现基因诊断食品安全、病原体及传染、肿瘤、遗传病等。

3 乳中有害微生物检测方法

不论是用于生产、零售还是未指明用途的乳和乳制品，绝大多数国家对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、弯曲杆菌、产气夹膜梭菌以及大肠杆菌5467均要求不得检出，而大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的检测则有不同的限量标准[3]。

3.1 微生物学检测方法

传统的微生物学检测方法有标准平板计数法（SPC）和显微镜直接观察法（DMC），是最普通的活菌总数测定法，也是绝大多数企业和质检部门最常用的两种方法。传统的微生物学检测方法具有所需设备简单，成本相对较低的优点，但其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度较低，并且对于有些细菌无法给出正确鉴定[4]。皿膜系统与即用胶系统法、疏水网格滤膜法、螺旋板系统均是学者们对这两种方法在提高操作效率和细胞计数方面的改进。疏水网格滤膜法优点是浓缩靶细菌,去除样品中的抑制因子,转移过程不需要再悬浮以免使菌体遭受物理破坏。滤膜法被广泛应用于生乳、巴士杀菌乳的质量管理中。

此外，为了克服人工计数的缓慢与疲劳，许多学者发明了全自动菌落计数系统，如英国Bibby SC5菌落计数器，Spiral Biotech公司的CASBATM，Celsis公司的Scan500及Synopitics公司的全自动菌落计数器，均可快速、准确地计数。

3.2 生物电化学方法

生物电化学方法[5]是指通过电极测定生物量产生或消耗的电荷提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位等会发生相应变化，所以可通过分析这些电化学参量的变化，实现对微生物的快速测定。在牛奶的检测中常见的有还原试验法；电导、阻抗法；生物传感器法。还原试验法避免了色素的生色灵敏度低、不能迅速测量的缺点。有的学者使用电阻抗技术快速检测牛奶中的大肠菌群。电导、阻抗法的缺点是必须先做出标准曲线，需要时间长。应用于乳品检测的此类产品主要有英国的MALTHUS微生物分析仪和法国的Bactometer微生物监测仪等。

3.3 免疫学检测方法

免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。运用于乳中致病菌的免疫学方法主要有免疫磁性分离技术、酶联免疫吸附技术（ELISA）、酶联荧光免疫吸附技术（VIDAS）等。各种免疫学方法的基本过程是相同的，先要进行病原菌的富集培养，再对富集物进行免疫检测和分析。前者需18～24h，甚至更长时间，而免疫检测过程则仅需几小时，甚至几分钟。因此可以采用免疫磁珠分离方法或免疫膜富集技术等减少样品的富集时间。当然，免疫学方法也有许多需要改进的方面，主要包括交叉反应、假阳性多、灵敏度偏低。在英国，免疫磁性分离技术主要应用于牛奶中大肠杆菌O157：H7的[6]监测。而Tsai等[7]用ELISA对奶酪和酸牛奶中的杂色曲霉、多主枝孢、白地霉、卷枝毛霉和产黄青霉进行了检测。

3.4 分子生物学方法

3.4.1 PCR技术

PCR是一种在体外快速扩增特异目标基因的技术。它可以在试管中建立反应，获得足够数量的DNA拷贝。PCR历史发展为3个阶段：定性PCR（电泳法）、酶免法定量PCR、实时荧光定量PCR。定性PCR具有快速、灵敏、特异等优点，可以克服传统检测方法的缺点和不足。但过程比较复杂；不能区分有活性和没有活性的细菌；使用的染色剂溴化乙啶是致癌物质，可能危及操作人员的健康。实时荧光定量PCR技术比定性PCR技术发明晚将近10年，相比定性PCR，它有如下突出优点：荧光定量PCR反应过程实时监测、荧光定量重复性好、基因定量分析——稳定性好、荧光检测——浓度梯度试验线性范围宽、荧光定量在对数期进行定量分析等优势。实时荧光定量PCR技术采用国际通行的检测标准进行乳品中阪崎肠杆菌的检测。

2005年5月20日，由中国检验检疫科学研究院和天津出入境检验检疫局牵头完成的《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准通过审定。这项标准的出台，解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌无标准、无检测方法的问题。另外，多部国家标准明确要求用PCR方法检测阪崎肠杆菌、食品中致病菌等。如《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》SN/T1632.1—2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法；2006年国家出台的《婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则》中明确要求采用国际通行的“荧光PCR仪”作为出厂检验必备设备，此要求已成为乳品企业生产许可证核发的必要条件。

在学术研究方面，胡建华[8]等采用快速常规PCR和定量实时PCR相结合，对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测，检测敏感度可达到2 mL-1，检出时间小于20 h。新建的PCR方法适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要，具有较高的实用和推厂价值。吕艳[9]等人利用PCR技术可在5 h内检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，最低检出限度35 ng/μL。赵宁[10]等人采用过滤富集菌体后PCR技术来检测原料乳中蜡样芽胞杆菌。马冬[11]等人利用PCR技术检测的是乳品中大肠杆菌。总体来说，PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、抗污染能力强（荧光PCR）、容易操作等特点（见表1）[12]。但PCR方法容易受到乳品成分（如蛋白）的干扰，抑制PCR反应的顺利进行。所以，乳品样本的前期处理及富集增菌技术还需进一步的研究。

表13 种检测方法的比较

3.4.2 ATP生物荧光技术

ATP生物荧光技术的原理[13]是ATP分子能量通过荧光酶复合物的作用转变为光，荧光强度与ATP浓度在一定范围内呈线性相关，而ATP在生物活细胞内的含量大致恒定，以此可推测被检样品中微生物数量。ATP生物荧光技术检测乳制品中的细菌总数及特异性病原菌具有简便、快速、灵敏等特点，在原料奶的验收、乳制品货架期预测及抗生素、细菌、噬菌体残留的检出等方面应用前景广阔。Samkutty等利用线性回归方程和ATP值预测了原料乳中的菌落总数[14]。在卫生监测中，ATP生物荧光技术5 min即可检出结果，其数据与平板计数法的结果相关性大于80%。

3.4.3 液相芯片技术

液相芯片技术 （MASA）是一种全新微量分析技术。其原理是将流式细胞术与荧光标记检测相结合，把针对不同目标分子的探针与不同荧光值的微球共价偶联，然后使其与目标分子在悬液中特异性结合，通过荧光信号特异性检测到目标分子[15]。其特点是高灵敏性、高准确度、重现性好、高通量多指标同步分析，对单孔内多达100种不同的反应同时进行检测。其缺点是检测成本昂贵，达不到低成本检测的目的。陈昱[16]等人运用建立的液相芯片检测体系对牛奶中志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌0157进行了检测。液相芯片技术检测致病细菌，综合了PCR和核酸杂交的优点，无需培养直接分析，在微生物定性检测以及基因分型等方面独具优势。

3.5 分析化学技术

随着分析化学技术的日新月异,很多仪器分析手段和方法如高效液相色谱[17]（HPLC）、气相色谱（GC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）等，已显示出了在微生物检测中的潜力。这些方法不同于依赖微生物生物学特征的检测方法，而是通过分析微生物的化学组成（生物标志物）来区分和鉴定微生物，开辟了检测和鉴定微生物的新途径。但在乳品有害微生物检测中的应用较少。

4 乳品中微生物检测的发展方向

综上所述，乳中微生物的检测方法多种多样，各有优缺点，可以采用多种方法联合使用的策略来提高检测灵敏度和检测效率。但是，乳品从源头到消费者饮用经历原料验收、运输、生产、包装、销售等环节，任何环节都存在污染的风险，确保全程实时检测是乳品微生物检测接下来的发展方向。

4.1 在线检测

目前，在线检测成为乳品中致病菌检测的发展趋势。在国外，超声波技术、生物传感器[5]和高效毛细管电泳分析技术已被应用于乳品检测及在线检测[18]，这些方法具有测量快速、操作简单和信号可控性等实时检测特点。黄曲霉毒素的去毒及在线检测技术是一项牛奶加工的关键技术，具有巨大的市场潜力和重大的社会效益，特别是牛奶中AFT的去除技术是国际上牛奶加工尚未完全攻克的技术。该技术产品具有国际竞争力。采用先进的生物工程技术利用生物酶研制AFT反应器、生物传感器和“自生”式免疫亲和柱等系列产品，用于AFT的去毒和分析检测。“自生”式免疫亲和柱是国际上牛奶加工需要的关键技术。中国乳品致病菌的在线检测技术与设备仍处在初级阶段，多数企业还在采用传统的检测方法。在线新技术的研发和应用将是我国乳品中致病菌检测方法的未来发展趋势。随着科学技术和各个学科的交叉发展，在线检测最终将彻底改变乳中致病菌检测的现状和传统的观念，实现高效、优质、廉价的统一。

4.2 现场检测

随着社会的发展和人们生活水平的提高，食品检测现场化、家庭化的呼声越来越高。相应地，对食品检测仪器的小型化、智能化、集成化、便携式的要求也越来越迫切。这些仪器的研制和生产，是今后乳品中微生物检测技术的另一发展趋势。当前，学者们提出的构建生物芯片及缩微芯片理念，将进一步面向现场和速测方面。

缩微芯片实验是在一个芯片上包含了分析所具备的一切重要部分：样品处理、反应试剂、检测器等。一些所谓芯片实验室的技术已经市场化，如基因芯片。芯片技术将越来越多地进入乳品类食品病原菌检测技术领域，实现检测系统的集成化、一体化。我国国家生物芯片中心等单位已开发并生产食源性致病菌检测、食源性病毒检测和兽药残留检测的生物芯片技术平台（仪器和试剂盒），未来的检测仪器与计算机紧密结合，自动采集数据、处理数据，更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一条龙，形成检测的自动化系统。

将纳米技术与生物传感器技术相结合，检测乳品中致病菌的方法在国外已有相关报道，而我国还未涉及。纳米结构通常是指尺寸在100 nm以下的微小结构。像一个单一细胞膜一样的纳米传感器将具有其他传感器无法比拟的灵敏度和快速的响应时间。生物传感器的纳米化，可使人们在市场上直接检测食品成为可能[19]。

近年来发展迅速的电子鼻和电子舌等仿生技术和传感器技术[20,21]，能够快速反应出被测样品的整体特征信息，在乳制品品质及货架期监控等方面的应用研究异常活跃。目前，电子鼻在微生物方面的检测针对不同的腐败菌种类及其生长规律进行研究。针对高危险致病性微生物的检测还有待于研究。

4.3 低成本检测

现代检测技术存在共性的问题：检测成本高。昂贵的检测仪器及试剂并不符合我国检测行业的标准，也不符合我国国情，尤其是对基层食品检测工作。我国农村人口高达9亿，农村市场是乳品消费的一大主力。所以，农村市场的乳品检测监测势在必行。而昂贵的检测成本对于基层食品检测负担太大，阻碍检测工作的进行。而且，检测技术的不断进步，必然要求不断降低产品成本，提高灵敏度、稳定性和延长寿命。这些特性的改善也会加速检测仪器现场化、商品化的进程。

5 结束语

乳品安全是一个重大的公共卫生问题。研究和应用先进的安全检测技术，可有效监控乳品中的危险因素，预防和控制食源性疾病的发生。乳品中各类微生物检测方法各自表现出不同的优缺点[22]：如传统的增殖培养、生化试验等方法，鉴定过程时间长；免疫学方法快速、灵敏度高，但容易出现假阳性、假阴性；VIDAS等虽然快速准确、通量大，但只能鉴定到属，仅适用于初筛，而且费用颇高。基因芯片、蛋白质芯片准确、通量大，但制作费用太高，并且菌种的选择性富集培养仍属研究重点[23]，不利于普及。

建立更灵敏、更有效、更可靠、更简便的微生物检测技术是保证乳品安全的迫切需求和乳品微生物检测技术的发展趋势。生物技术是21世纪最具活力的技术，随着分子生物学各种检测方法之间交叉发展、相互融合、联合使用，必将为我国乳品生产构建起一道有效的安全屏障。多种检测技术以及各学科的交叉发展有望能解决上述需求。

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Introduction and the development direction on the detection technique of harmful micro-organisms in dairy products

ZHANG Shou-wen1，YIN Lei2，ZHOU Yu-ling2
（1.Heilongjiang Food and Drug Administration，Harbin 150020,China）
（2.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076,China）

This paper,in terms of food safety,systematically reviews disadvantage of main high-hazard pathogens in dairy products and the historical process of the detection method,the detection technique of harmful micro-organisms in milk on current domestic and international,the direction of development of microbial detection techniques in milk.

dairy products；micro-organisms；detection technology；the development direction

TS252.1

B

1001-2230（2010）01-0035-04

2009-09-30

张守文（1956-），男，教授，主要从事食品科学，工程和食品安全管理方面的研究。