蒙古国传统发酵乳中部分乳杆菌16S rRNA-RFLP的分类

高娃，于洁，乌兰，艾日登才次克，孙志宏，刘文俊，孟和毕力格，孙天松，张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

蒙古国传统发酵乳中部分乳杆菌16S rRNA-RFLP的分类

高娃，于洁，乌兰，艾日登才次克，孙志宏，刘文俊，孟和毕力格，孙天松，张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

采用16S rRNA-RFLP技术对分离自蒙古国乌兰巴图周边地区酸马奶中部分乳杆菌进行分类和鉴定。结合HaeIII，AluⅠ和HinfⅠ三种限制性内切酶RFLP的分析，将26株乳杆菌鉴定为Lactobacillus helveticus（18），actobacillus plantarum（7）和Lactobacillus casei（1）。在此基础上采用了16S rRNA基因序列分析的方法对本研究的26株乳杆菌进行验证，实验结果与16S rRNA-RFLP鉴定结果相吻合，表明此方法是一种快速、准确用于大量乳杆菌分类和鉴定的方法。

乳杆菌；鉴定；16S rRNA基因；RFLP

0 引 言

乳杆菌是革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶阴性，无芽孢，不运动或很少运动，无鞭毛，细胞形态呈杆状，发酵可利用糖类产生乳酸的细菌[1]。长期以来对乳杆菌属的分类鉴定主要是以表型特征和生理生化特性为依据来判定其归属，但是这种方法对于乳杆菌属的鉴定有其必然的局限性：首先耗时耗力，工作量大，很难适应当前快速发展，据统计2007年乳杆菌属有145个公认的种及亚种[2]，并已每年新增10～20个新种的速度递增。其次，主观误差比较大，实验重复性差。第三，对于大部分乳杆菌而言，表形特征和生理生化特性极其相似，仅仅依靠传统的鉴定方法很难进行有效的区分。随着分子生物学和相关技术的发展，分子标记技术以及基因水平的研究以其快速、准确、灵敏的优点逐渐被用于乳酸菌的分类鉴定[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）菌株来源。26株分离自蒙古国乌兰巴图周边地区酸马奶中的乳杆菌由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌保藏中心提供（已完成传统鉴定方法分类鉴定[4]）。

（2）标准菌株。Lactobacillus casei AS1.2435，Lacto-bacillus helveticus AS1.1877，Lactobacillus plantarum AS1.2437，Lactobacillus rhamnosusAS1.2134，Lactobacillusacidophilus AS1.1878，Lactobacillus fermentum AS1.1880，Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii ATCC 11842，LactobacillusanimalisATCC35046，Lactobacilluscoryniformissubsp.coryniformis AS 1.1879。

（3）试剂和仪器。MJ PTC 200梯度基因扩增仪，UVP CDS8000凝胶成像分析系统,Taq DNA聚合酶，限制性内切酶等。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌全基因组的提取

采用CTAB法和冻融法[5，6]相结合的方法来提取乳杆菌的基因组DNA。取适量供试菌株的菌体于1.5 mL离心管中，加入500 μL TE缓冲液（浓度为10 mmol/L的Tris·Cl和1 mmol/L的EDTA,pH=8.0） 充分振荡均匀后置于液氮中冻结（约5 min），取出迅速放入65℃水浴5 min使其充分融化，重复冻融步骤4次后加入60 μL质量分数为10%的SDS和10μL蛋白酶κ（质量浓度为20 g/L）置于55℃水浴锅中进行消化；1 h后取出加入100 μL NaCl（浓度为5 mol/L）和80 μL CTAB/NaCl溶液（质量分数为10%的CTAB和浓度为0.7 mol/L的NaCl）混匀后65℃水浴15 min；然后用苯酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）混合溶液抽提2次去蛋白，澄清的上清加等体积预冷的异丙醇和0.1倍体积浓度为3 mol/L的NaAc沉淀DNA，以12 000 r/min离心3 min后，去上清并用体积分数为70%乙醇洗涤2次；自然风干后溶于适量的TE缓冲液储存于–20℃备用。

1.2.2 乳酸菌16S rRNA基因的扩增

16S rRNA基因扩增引物采用通用引物[7，8]，正向引物为27f（对应于Escherichia coil 8-27位碱基）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′；反向引物为1495r（对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR扩增片段约为1450bp。采用50 μL反应体系进行PCR扩增,扩增条件：94℃5 min预变性；94℃1 min,58℃1 min,72℃2 min,30个循环；72℃延伸10 min。取2 μL产物用质量分数为0.1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 限制性内切酶的选取

在核糖体数据库[9]搜索并下载所有公布的已知16S rRNA基因序列，通过NEBcutter V2.0[10]软件，分别对已知序列菌株的16S rRNA基因扩增产物进行酶切，并用质量分数1.4%的琼脂糖凝胶进行模拟电泳。通过对电泳图谱的分析初步选出适合乳酸菌的核酸内切酶。

1.2.4 16S rRNA基因扩增片段的限制性酶切分析

用选取的限制性内切酶对16S rRNA基因PCR扩增产物进行酶切。酶切反应总体积为20 μL，含2 μL PCR反应产物，2U的内切酶和2 μL的10×反应缓冲液。在酶的最适温度下水浴3 h后，取4 μL酶切产物在5%的聚丙酰胺凝胶上150V电压进行电泳，银染后扫描图片，并进行分析。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析和构建系统发育树

26株乳杆菌的16S rRNA基因由上海桑尼生物技术有限公司测序。测定的序列用BLAST在GenBank中搜索相近序列。将测序菌株与标准菌株的16S rRNA序列首先使用ClustalX[11]将序列进行完全比对，然后用Neighbor-joining法[12]取得序列的进化距离。使用MEGA 4软件[13]作出系统进化树，数据自展重抽样次数1000次。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA基因的扩增检测

所有供试菌株PCR产物经质量分数为0.1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在约1500 bp处出现荧光条带（如图1）。说明PCR产物为阳性结果，且条带清晰、唯一可适合于RFLP分析和16S rRNA基因测序。

图116 S rRNA的PCR扩增产物电泳

图1中，1为IMAU20016；2为IMAU20019；3为IMAU20025；4为IMAU20006；5为IMAU20009；6为IMAU20020；7为IMAU20026；8为Lactobacillus helveticus AS1.1877；9为Lactobacillus casei AS1.2435；M为DL2000 marker。

2.2 限制性内切酶的选取结果

采用NEBcutter V2.0软件选出3种限制性内切酶HaeⅢ、HinfⅠ和AluⅠ，酶的识别序列和酶切位点是：HinfⅠ：5′-G/ANTC-3′；HaeⅢ：5′-GG/CC-3′；AluⅠ：AG/CT；模拟电泳图谱表明较适用于乳杆菌的鉴定，由于HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ 酶切位点较少，菌株间有明显差异。

2.3 16S rRNA基因限制性酶切结果

利用限制性内切酶HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ分别对26株乳杆菌和9株标准菌株的16S rRNA片段进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后将标准菌株的实际电泳图谱与模拟电泳图谱相比，相同菌株的主要带型相同，酶切结果如图2所示。

图2 部分菌株和9株标准菌株限制性酶切图谱

图2中，1为IMAU20016；2为IMAU20009；3为IMAU20019；4为IMAU20020；5为IMAU20025；6为IMAU20006；7为IMAU20026；8为Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis AS 1.1879；9为Lactobacillus rhamnosus AS1.2134；10为Lactobacillus acidophilus AS1.1878；11为Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii ATCC 11842；12为Lactobacillus plantarum AS1.2437；13为Lactobacillus fermentum AS1.1880；14为Lactobacillus helveticus AS1.1877；15为Lactobacillus casei AS1.2435；16为Lactobacillus animalis ATCC 35046；M为DL2000 marker。

由图2（a）可以看出，待测菌株中泳IMAU20016；IMAU20019；IMAU20025（道1，3，5）的带型与标准菌株Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus的带型一致；IMAU20009；IMAU20020；IMAU20026（ 泳道2，4，7）的带型只与Lactobacillus plantarum相同，所以初步将其归为Lactobacillus plantarum。IMAU20006（泳道6）的带型与标准菌Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus casei的带型特别相似，所以可判定IMAU20025为其中的一种菌。

由图2（b）可以看出，待测菌株中IMAU20016，IMAU20019，IMAU20025（道1，3，5）的带型与标准菌株Lactobacillus helveticus的带型一致，且与Lactobacillus acidophilus的带型差异很大，故可判定其为Lactobacillus helveticus；IMAU20006（泳道6）的带型只与Lactobacillus casei相同，而且和Lactobacillus rhamnosus的带型有差异，所以将其初步鉴定为Lactobacillus casei。待测菌株中IMAU20009；IMAU20020；IMAU20026（ 泳道2，4，7）带型与Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus plantarum，Lactobacillus animalis的带型均很相近；但是AluⅠ酶切图谱显 示 待 测 菌 株 中IMAU20009，IMAU20020，IMAU20026（泳道2，4，7） 带型只与Lactobacillus plantarum一致，所以初步鉴定其为Lactobacillus plantarum。

两种酶切图谱已经初步将乳杆菌鉴定到种的水平，采用第三种限制性核酸内切酶HaeⅢ的酶切图谱（图2（c）可以进一步验证菌株的鉴定结果。结合HaeⅢ，AluⅠ和HinfⅠ进行酶切，通过与标准菌株比对，将26株乳杆菌鉴定为Lactobacillus helveticus（18/26），Lactobacillus plantarum（7/26）和Lactobacillus casei（1/26）。

孟和毕力格等[3]通过传统鉴定方法形态观察、生理生化试验、糖发酵试验将这26株归为18株L.acidophilus Group，7株L.plantarum和1株L.casei。这结果与本文的实验结果不是完全一致，其中18株L.acidophilus Group在本研究中都鉴定为L.helveticus。因此，在此基础上采用了16S rRNA基因序列分析的方法对本研究的26株乳杆菌进行进一步验证。

2.4 16SrRNA基因序列分析

将26株乳杆菌的16S rRNA基因序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的相应序列进行BLAST分析，比对后可知：18株待测乳杆菌与L.helveticus DSM20075的同源性都在99%以上，鉴定为L.helveticus；7株待测乳杆菌的16S rRNA基因序列与菌株L.plantarum JCM1149的同源性是100%，认为这7株菌为L.plantarum；1株待测乳杆菌与L.casei ATCC393的同源性是99%，鉴定该菌株为L.casei。

2.5 测序结果及系统发育树分析

图326 株待测菌株与标准菌株16S rRNA序列系统发育树

将这26株菌的16S rRNA序列用MEGA4软件中的Neighbor-joining法绘制的系统发育树，并比较了它们之间的进化距离，结果如图3所示。由图3可以看出：从总体上可将其分为3个大群，即与IMAU20006与L.casei ATCC393归 为 第 一 群 ；IMAU20009，IMAU20013，IMAU20024，IMAU20015，IMAU20020，IMAU20026，IMAU20029与L.plantarum JCM1149归为第二群；余下的18株菌与L.helveticus DSM20075非常接近的归为第三群。由第一群到第三群的16S rRNA序列分析结果与RFLP结果基相吻合。

3 讨 论

实验结果表明，应用16S rRNA-RFLP技术可将这些乳杆菌快速、简便分类并准确的将其鉴定到种的水平。实验中采用细菌通用16S rRNA引物扩增效果较好，结果清晰可靠，条带单一，有利于16S rRNA片段的酶切。对于乳杆菌选出的3种限制性内切酶HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ酶切位点相对较少，聚丙烯酰胺凝较电泳后条带清晰、简单便于分析，然而由于某些酶切位点处于16S rRNA的保守区域，所以有些不同菌株的酶切图谱非常相近。如HinfⅠ酶切图谱中Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus plantarum的条带长度与数量相同，无法对未知菌株IMAU20009，IMAU20020，IMAU20026进行鉴定，但AluⅠ酶切图谱中却不同，能够很容易将其鉴定为Lactobacillus plantarum，因此对于乳杆菌的鉴定需要几种酶互相补充。

从分类学的角度看，生理生化特征仍然是大多数实验室进行常规菌种鉴定最为常用的方法，然而不同种属的乳杆菌培养条件和营养需求差异很小，所以采用传统的鉴定方法很难对其进行准确的鉴定[15]。孟和毕力格等[5]通过传统鉴定方法形态观察、生理生化试验、糖发酵试验将其中18株L.helveticus鉴定为L.acidophilus Group。这可能是由于两类乳杆菌在糖发酵试验中所发酵的糖很多是一样的，仅在Cellobiose、Esculin、Salicin这三个糖的发酵中有明显区别。L.helveticus不发酵这三种糖，而L.acidophilus Group发酵。由于这样很小的差异，用人为的判断是很难进行准确的归类，然而16S rRNA-RFLP技术可以结合多种限制性内切酶进行准确的鉴定。

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Classify research of lactobacillus from traditional fermented milk in mongolia by 16S rRNA-RFLP methods

GAO Wa,YU Jie,WuLan,Airidengcaicike,SUN Zhi-hong,LIU Wen-jun,Menghebilige,
SUN Tian-song,ZHANG He-ping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018,China）

In this study,Lactobacillus were rapid classified and identified by the combined method of 16S rRNA-RFLP and Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）.26 lactobacilli were were identified as Lactobacillus helveticus（18）,L.plantarum（7）and L.casei（1）by（RFLP）analysis using a set of restriction enzymes,AluI,HaeIII and HinfI.On this basis,these strains were determined by 16S rRNA gene sequences analysis.It was shown that 16S rRNA-RFLP was coincidence with the sequenced results.In conclusion,this method can be used as a quick and reliable classification and identification of lactobacilli.

lactobacilli；identification；16S rRNA gene；RFLP

Q939

A

1001-2230（2010）01-0004-04

2009-06-30

国家863计划项目（No.2006AA10Z345,2007AA10Z353），国家自然基金项目（No.30660135，30800861），现代农业产业技术体系项目。

高娃（1985-），女，硕士研究生，从事乳品微生物方面的研究。

张和平