三氮唑类西佛碱与牛血清白蛋白相互作用的光谱法研究

梅 平，刘 洋 刘 义 韩晓乐 孙晓红 张业中

(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023)(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023 武汉大学化学与分子科学学院，湖北 武汉 43007)(武汉大学化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072)(西北大学化工系，陕西 西安710069)(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023)

三氮唑类西佛碱与牛血清白蛋白相互作用的光谱法研究

梅 平，刘 洋 刘 义 韩晓乐 孙晓红 张业中

(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023)(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023 武汉大学化学与分子科学学院，湖北 武汉 43007)(武汉大学化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072)(西北大学化工系，陕西 西安710069)(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023)

用荧光光谱及紫外吸收光谱方法，研究了一种三氮唑类西佛碱与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，分析了不同温度下西佛碱对BSA的荧光猝灭作用。研究表明三氮唑类西佛碱对BSA有较强的荧光猝灭作用，西佛碱对BSA的荧光猝灭作用属于静态猝灭。并根据修正的Stern-Volmer方程，计算了西佛碱与BSA间的结合常数Ka，根据非辐射能量转移理论求得了西佛碱与BSA间的结合距离r；用Van’t Hoff方程计算了热力学参数，用三维荧光光谱研究了BSA构象的变化和用分子对接方法研究了西佛碱与BSA的结合位点，热力学数据表明二者主要以氢键和范德华作用力结合。

西佛碱；牛血清白蛋白(BSA)；荧光猝灭；三维荧光光谱；分子对接

西佛碱是一类有甲亚胺基官能团的化合物，研究表明这类化合物具有抗癌、抗炎、抗菌等生物活性，是一类有医学及制药学应用前景的化合物。血清白蛋白(SA)是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，作为许多内源性和外源性化合物的存储和转运蛋白，可与许多化合物分子发生相互作用。药物分子进入血液后不同程度地与血清白蛋白结合，可以控制药物向受体释放，避免药物迅速代谢。药物与血清白蛋白相互作用的研究是介于化学和生命科学之间的边缘性课题，是化学生物学研究的重要内容。在分子水平上研究药物分子和生物大分子的相互作用，探索药物与蛋白质、核酸的结合特性，对于阐明药物的作用机理和进行药物设计以开发新药具有理论和实践意义[1]。笔者采用荧光光谱及紫外光谱研究了一种三氮唑类西佛碱衍生物3-巯基-4-(2,5-二氯苯基亚甲胺基)-5-乙基-1,2,4-三氮唑与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。计算了其与BSA 的结合常数、结合距离、热力学参数等，并用分子对接技术研究了其与BSA的结合位点。

1 材料和方法

1.1仪器与试剂

1)仪器 LS-55荧光光谱仪(美国PE公司)； UV-4802紫外可见分光光(尤尼科上海公司)； HS-4(B)智能恒温水浴(成都仪器厂)。

2)试剂 牛血清白蛋白(BSA，纯度gt;95%)，用pH7.4的PBS缓冲液配制，浓度为2.0×10-6mol/L，4℃保存；西佛碱(西北大学化工系提供)；其他试剂为分析纯；试验用水均为二次去离子水。

1.2试验方法

1)荧光光谱法 测定不同研究体系溶液在不同温度(298、304、310K)的荧光发射谱。

2)吸收光谱法 测定各溶液的吸收光谱及与牛血清白蛋白物质的量之比为1∶1的药物溶液的吸收光谱。

2 结果与讨论

c(BSA)=2.0×10-6mol/L；c(西佛碱)A-K: 0， 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20×10-7mol/L。图1 西佛碱对牛血清白蛋白荧光光谱的影响 (T=298 K,λex=280nm)

图2 不同温度下西佛碱猝灭牛血清白蛋白荧光的Stern-Volmer关系图

2.1荧光发射光谱及荧光猝灭机制

1)荧光发射光谱 蛋白质分子中因含有3种芳香族氨基酸残基——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而产生内源荧光。荧光猝灭指任何降低样品荧光强度的过程。图1是系列不同浓度的西佛碱对BSA的荧光猝灭图。从图中可以看出，随着西佛碱浓度的增加，BSA体系的荧光强度逐渐降低，表明西佛碱与BSA之间发生了结合作用，从而猝灭了BSA的内源荧光强度。

2)荧光猝灭机制 荧光猝灭过程通常可以分为动态猝灭作用和静态猝灭作用。无论是单一的动态猝灭还是静态猝灭，其过程均遵守Stern-Volmer方程[2]：

F0/F=1+Ksv[Q]

(1)

式中，F0为未加猝灭剂时的荧光强度；F为加入猝灭剂后的荧光强度；Ksv称为Stern-Volmer猝灭常数；[Q]为猝灭剂的浓度。

由于动态猝灭依赖于扩散，温度升高时溶液的黏度下降，分子的运动加速，结果会导致扩散系数增大，从而增大猝灭常数。反之，温度升高可能导致基态配合物稳定性下降，从而减小静态猝灭的的程度，因此可以根据不同的温度下的BSA的猝灭情况来区分猝灭类型。为了研究西佛碱对BSA的猝灭机理，笔者分析了不同的温度条件(298, 304, 310K)下西佛碱对BSA的荧光猝灭情况(如图2)。从图中可以看出，直线的斜率随着温度的升高而下降，作线性回归计算各个温度下的猝灭常数，列于表1。表1中数据显示，随着温度的升高，猝灭常数呈现规律减小，表明西佛碱与BSA的作用是形成复合物的静态猝灭。

表1 不同温度下西佛碱与牛血清白蛋白作用的Stern-Volmer猝灭常数

2.2西佛碱与BSA相互作用的结合常数

在静态猝灭作用中，荧光强度与猝灭剂的关系可由修正的Stern-Volmer方程表示[3]：

(2)

式中，F0是不存在猝灭剂时蛋白质的荧光强度；F0-F是加入猝灭剂后荧光强度的变化；Ka是结合常数；f为修正常数。

以F0/(F0-F)对1/[Q]作图可得一条直线，通过斜率和截距求出西佛碱与BSA的结合常数Ka。图3为不同温度梯度(298、304、310K)下的西佛碱对牛血清白蛋白荧光猝灭的修正Stern-Volmer关系图，计算的结果列于表2。

表2 不同温度下西佛碱与牛血清白蛋白的结合常数

2.3西佛碱与BSA相互作用的结合距离

根据荧光共振能量转移理论[4]可以求出西佛碱在BSA上的作用位置与色氨酸残基之间的平均距离。图4为西佛碱与BSA的物质的量之比为1∶1时，西佛碱的吸收光谱与BSA荧光发射光谱的重叠图。将图4中的重叠部分积分，可求出结合距离r=2.6nm。r在2～8nm之间，符合能量转移理论，说明西佛碱与BSA之间通过有效的能量转移而促使蛋白质荧光猝灭的可能性很大。

2.4西佛碱与BSA的结合模式

药物与生物大分子之间的作用力主要包括氢键、范德华力、静电作用力及疏水作用力。通过测定药物与蛋白作用的焓变ΔH和熵变ΔS，可判断二者之间的作用力类型。

通过公式：

(3)

以lnKa对1/T拟合可得到ΔH、ΔS，进而由公式：

ΔG=-RTlnKa

(4)

求得吉布斯自由能变(ΔG)，数据见表3。

根据Ross[4]的报道，当ΔHgt; 0、ΔSgt;0时，体系为疏水作用力；当ΔHlt;0、ΔSlt;0时，体系为氢键或范德华力；当ΔH≈ 0、ΔSgt; 0时，体系为静电作用力。由计算结果(ΔHlt; 0、ΔSlt; 0)可知该西佛碱与BSA主要是以氢键和范德华力结合。

表3 不同温度下西佛碱与牛血清白蛋白作用的热力学参数

2.5西佛碱对BSA构象的影响

试验测定了在温度298K时BSA的三维荧光光谱(图5(a))和西佛碱∶BSA=1∶1时的的三维荧光光谱(图5(b))，从峰的类别看:图5(a)和图5(b)中的2条逐渐升高的“山脊”形峰的共同特征是λex=λem(Δλ= 0),是瑞利散射线。图5(a)中，2个荧光峰的峰顶坐标(F,λex/λem)分别peak1(579.88, 280.00/ 358.21) , peak2(565.28, 220.00 /359.03) 。而图5(b)中,当加入与BSA的物质量之比为1∶1的西佛碱后,两峰坐标(F,λex/λem)分别为peak1(320.05 ,280.00/357.50)，peak2(308.78,220.00/359.00)。相比较荧光强度分别降低259.83(peak1) 和256.50 (peak2) ,荧光发射峰位置并没有明显的红移或蓝移，表明西佛碱的加入没有引起BSA构象明显的变化。

图5 牛血清白蛋白的三维荧光光谱和牛血清白蛋白-西佛碱体系的的三维荧光光谱

2.6西佛碱在牛血清白蛋白上结合部位的确定

图6 西佛碱与牛血清白蛋白相互作用的分子模拟

研究表明，牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HSA)具有高度的同源性(∽80%)蛋白质，且三维晶体结构非常的类似。药物主要与血清白蛋白的SiteⅠ和SiteⅡ位点结合，华法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)分别是SiteⅠ和 SiteⅡ位点的标记物[5]。为了确定西佛碱与牛血清白蛋白的结合位点，笔者从PDB数据库得到人血清白蛋白(HSA)的三维晶体结构，以与华法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)的结合口袋为活性位点，用氨基酸残基匹配的方法确定了牛血清白蛋白(BSA)的SiteⅠ和SiteⅡ位点。用SYBYL分子模拟和药物设计软件进行西佛碱与牛血清白蛋白(BSA)的分子对接试验(图6)，试验结果表明西佛碱在SiteⅠ和SiteⅡ位点都有结合，但主要结合位点在SiteⅠ结合位点。

3 结 论

1)试验表明西佛碱与牛血清白蛋白(BSA)有很强的相互作用，猝灭类型为西佛碱与BSA形成复合物的静态猝灭，在温度(298、304、310K)下的结合常数分别是5.882×105L/mol，3.608×105L/mol，1.994×105L/mol。

2)热力学参数ΔH= -69.328kJ/mol，ΔS= -122.228J/(mol·K)，可以得到作用力类型主要为氢键和范德华作用力。

3)根据非辐射能量转移理论求得了西佛碱与BSA间的结合距离r=2.6nm,三维荧光光谱表明西佛碱的加入没有导致BSA构象明显的变化，分子对接试验表明西佛碱主要结合在BSA的SiteⅠ结合位点。

[1]Deepa Sinha, Anjani K. Tiwari, Sweta Singh, et al. Synthesis, characterization and biological activity of Schiff base analogues ofindole-3-carboxaldehyde[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 43:160～165.

[2]徐金明, 陶慧林, 高炅杨.穿心莲提取物与牛血清白蛋白相互作用的研究[J]. 分析测试学报,2008,27(5):181～184.

[3]Hu Yanjun, Liu Yi, Xiao he. Investigation of the Interaction between Berberine and Human Serum Albuminb[J].Biomacromolecules, 2009, 10:517～521.

[4]Zhang Yezhong, Dai Jie, Zhang Xiaoping，etal.Studies of the interaction between Sudan I and bovine serumalbumin by spectroscopic methods[J]. Journal of Molecular Structure, 2008, 888:152～159.

[5]Yue Yuanyuan, Chen Xingguo, Qin Jin，etal.A study of the binding of C.I. Direct Yellow 9 to human serum albuminusing optical spectroscopy and molecular modeling[J].Dyes and Pigments, 2008,79:176～182.

[编辑] 洪云飞

O614

A

1673-1409(2009)03-N017-04

2009-06-08

中国石油科技创新基金项目(2008D-5006-02-01)。

梅平(1961-)，男，1982年大学毕业，硕士，教授，现主要从事物理化学方面的教学与研究工作。