氨萘菲特类似物光谱性能和抗肿瘤机制研究

吴爱斌

(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023)

氨萘菲特类似物光谱性能和抗肿瘤机制研究

吴爱斌

(长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023)

通过紫外光谱、荧光光谱和流式细胞技术研究了一系列新型的氨萘菲特类似物5a-c的光谱性能及其抗肿瘤作用机制。研究结果表明，化合物5a-c表现为中等强度的DNA嵌入剂，该系列化合物能有效地引起HL-60细胞周期阻滞并诱导凋亡。该工作为深入理解化合物5a-c独特的抗肿瘤活性提供了一定的化学生物学证据，并为其结构的进一步修饰和抗肿瘤性能的进一步优化提供了指导。

氨萘菲特；ctDNA；光谱；HL-60；抗肿瘤

萘酰亚胺类抗肿瘤药物是抗肿瘤药物发展中极其重要的一部分，受到人们广泛关注[1,2]。该类化合物具有平面、刚性、多环发色团结构，分子的稠环部分可以嵌入到DNA双螺旋碱基对之间，引起DNA双螺旋的拉伸、解旋和僵化。由于改变了DNA的拓扑结构，导致在生化水平上DNA的功能发生了封锁(如DNA聚合酶或拓扑异构酶的活性受到抑制等)而发挥药效[3]。该药物分子表面紧紧地挨着DNA碱基对的芳香杂环，在双螺旋链中以π-π共轭、偶极-偶极相互作用而使电荷分布达到稳定[4]。这些作用可以通过一些光谱现象(如紫外减色、荧光淬灭、1H-NMR化学位移高场移动等)来说明[5]。

图1 氨萘菲特类似物5a-c的结构

笔者曾报道了具有较好抗肿瘤活性的氨萘菲特类似物5a-c(图1)[5]，其对6种肿瘤细胞株的细胞毒性(IC50值)达到了μm数量级。下面，笔者主要通过UV(紫外光谱)、FL(荧光光谱)和FACS(流式细胞分析)等方法对该类化合物的光谱性能和抗肿瘤作用机制进行研究，为理解其独特的抗肿瘤性质提供了一定的化学生物学证据，并对其结构和性能的进一步优化提供指导。

1 试验部分

1.1仪器与试剂

BS-210S万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；PGENERAL TU-1901紫外-可见光谱仪；Hitachi F-4500荧光光谱仪；FACScalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)流式细胞仪，Modifit’s program(Becton Dickinson)自动分析细胞周期分布；ctDNA购于Sigma Aldrich公司；缓冲溶液为二次水配制。

1.2ctDNA溶液的制备

精确称量高度聚合的ctDNA溶解于10mm Tris-HCl、1mm EDTA、pH=7.5的缓冲溶液中。该溶液在260和280nm处紫外吸收的比值为1.8～1.9∶1，表明DNA充分从蛋白中游离出来，可以用于测试。通过Beer定律，计算出储备液浓度c(A=εcl，A、ε为紫外260nm处的吸光度和摩尔消光系数，ε=6600M-1；l为样品池的长度，一般取1cm)，并在4℃冰箱中至少平衡4d后使用[6]。

1.3样品溶液的制备

精确称量合成的目标化合物5a-c分别溶解于10ml DMSO(重蒸)中，配制成10-3M的储备液，用于FACS测试；吸取一定量的储备液用不同溶剂稀释，得到不同溶剂溶解的样品溶液，浓度为10-5M(DMSO含量lt;1%)，用于光谱测定。

1.4ctDNA滴定

分别配制化合物和ctDNA的浓度为10 μM和0～180μM的20mm Tris-HCl、50mm NaCl(pH7.5)、DMSO(lt;1% by volume)的缓冲溶液，溶液最终体积为10ml。该溶液于25℃在暗箱中连续振荡平衡6h后进行光谱测定。根据非线性方程[7]:

可以得到化合物与DNA结合常数Ka。其中，I0、I和I∞分别表示单独嵌入剂、嵌入剂与一定浓度DNA以及DNA饱和后嵌入剂的荧光强度；[DNA]0和[Q]0则分别表示DNA与嵌入剂的初始浓度。

1.5荧光量子产率的计算

以硫酸奎宁(ΦF= 0.58)为基准[8]，根据公式:

Φ(sample)=Φ(standard)×[A(standard)×S(sample)]/[A(sample)×S(standard)]

计算，式中Φ(sample)、Φ(standard)分别表示待测样品和标准物的荧光量子产率；A(sample)、A(standard)分别表示待测样品和标准物在激发波长下的吸光度；S(sample)、S(stabdard)分别表示待测样品和标准物的荧光发射峰面积。

1.6细胞周期分布测试

HL-60细胞与不同浓度的化合物培养一定时间后，于离心机中离心5min(1000rpm)，去除上层清液。细胞用PBS液清洗2次，用300μl PBS液和700μl 75%冰冷的乙醇固着过夜。室温下离心(1000rpm)收集固着细胞。将细胞重新悬浮于1ml PBS(100μl/1×105cells)中，加入0.5μl RNase A于37℃培养30min。加入碘化丙锭(50μg/ml)将DNA染色，用FACScalibur仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)分析大约20000个固着细胞，用Modifit’s程序(Becton Dickinson)自动分析细胞周期分布[9]。

2 结果和讨论

2.1紫外和荧光性质

以硫酸喹啉(0.1mol/L sulfuric acid,Φ=0.58)作为标准物[8]，测量了这些化合物在二氯甲烷、乙腈、乙醇、Tris-HCl(pH = 7.5)和HEPES(pH = 7.2)不同溶剂中的紫外吸收以及荧光光谱。从表1可以看到，随着溶剂极性的增加，化合物的最大吸收和发射发生一定程度的红移，呈现较小的正向溶剂化效应，其吸收强度变化不大，而荧光量子效率却显著降低。而且，不同的芳基取代基对荧光光谱也产生较大的影响，当取代基为磺胺基时，化合物的荧光量子产率相对较高。值得注意的是，化合物5a-c在缓冲溶液中的量子产率明显高于其在乙醇中的量子产率，这是因为N,N-二甲基氨基上的叔胺N原子在缓冲体系中被质子化而抑制PET(photo-induced electron transfer)过程发生，从而使得荧光得以部分恢复[10]。

表1 目标化合物在不同溶剂中的光谱性质

2.2ctDNA结合性质

化合物的细胞毒性和它与DNA相互作用能力有一定关联。嵌入作用是药物同DNA作用的一种方式，一般芳香化合物都是以这种方式同DNA作用的。这种模型不仅仅被NMR等分析证明，还有30多个小分子与寡聚核甘酸的嵌入复合物晶体经X-射线衍射而确定[11,12]。因此，嵌入模式已被广泛接受。当荧光化合物嵌入到DNA的碱基对之间，其荧光强度会增强或减弱，并且变化的强度与DNA形成复合物的量成正比，其表观结合常数Ka可由DNA浓度与荧光变化的关系式通过非线性拟合计算得到[7]。

代表性化合物5a和5c的滴定曲线如图2和图3所示。随着ctDNA的加入，化合物的光谱发生一定程度的变化，紫外光谱发生轻微的红移(5a：1～5nm；5c：1～3nm)和明显的减色现象(5a：56.2%～68.5%；5c：12.8%～57.6%)；荧光光谱则明显地淬灭(5a：76.7%；5c：63.5%)，其表观结合常数分别为1.29×106、4.92×104m-1。光谱测试表明该类化合物与DNA之间为经典的嵌入结合模式，且为中等强度的嵌入剂[13, 14]。很明显，化合物5a与DNA的结合能力强于5c，但与其细胞毒性之间没有明显地相关性。

图2 化合物5a的ctDNA滴定曲线

图3 化合物5c的ctDNA滴定曲线

图4 化合物5a-c的流式细胞图

2.3流式细胞分析

为了研究所合成的目标化合物可能的抗肿瘤作用机制，笔者通过流式细胞技术(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)研究了它们对细胞周期(Cell Cycle)所产生的影响[15, 16]。试验中使用HL-60细胞株，目标化合物的测试结果列于图4中。

从图4中可以看出，目标化合物5a-c明显对HL-60的细胞周期产生影响(G1、S、G2/M相对应的百分数明显发生变化)，引起细胞周期阻滞，并能显著诱导细胞凋亡(sub-G1或G0的百分数从0.72%增加到15.31%～22.58%)。具体表现为：化合物5a和5c表现出对HL-60细胞的G1、G2/M期最强的阻滞能力，其值分别为56.05%和27.66%；IC50浓度下，凋亡诱导能力最强的化合物为5b(22.58%)，化合物的凋亡诱导能力按b、c、a顺序递减变化，这表明芳基取代基的大小和构型对化合物的凋亡诱导能力有着重要影响，例如化合物5c(19.67%)的促凋亡能力比5a(15.31%)强但比5b(22.58%)弱；且化合物的细胞毒性与其凋亡诱导性能之间并没有显著联系。

3 结 语

笔者对氨萘菲特类似物5a-c的光谱性能及其抗肿瘤作用机制进行了研究，紫外和荧光光谱研究表明该类化合物为典型的ICT型分子；ctDNA滴定实验表明，化合物与DNA之间为经典的嵌入结合模式，为中等强度的嵌入剂；流式细胞分析表明，化合物5a-c能明显引起HL-60细胞周期阻滞，并强烈诱导细胞凋亡。该工作说明氨萘菲特类似物可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而呈现出较好的抗肿瘤活性，有望成为具有高效凋亡诱导作用的新型抗肿瘤药物的先导结构，用于进一步的结构优化设计。

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[编辑] 洪云飞

O622.6

A

1673-1409(2009)03-N026-04

2009-05-27

国家自然科学基金资助项目(90713026/C0508)。

吴爱斌(1973-)，男，1995年大学毕业，讲师，博士生，现主要从事有机合成和应用化学方面的教学与研究工作。