青钱柳提取物清除羟自由基和抑制脂质过氧化的作用

陈　薇　段小群　卢　曦等

[摘要] 目的 研究五种青钱柳提取物(CPS)清除羟自由基和抑制脂质过氧化作用。方法 采用组织匀浆MDA比色法测定不同浓度的CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的作用。利用Fenton 反应产生•OH,研究CPS对羟自由基的清除作用,计算半清除率(IC50)。结果 五种提取物均明显的具有抗脂质过氧化作用,在浓度为1.0 mg•ml-1时,对小鼠肝组织自发性MDA的抑制率大小为:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。CPS对•OH自由基IC50大小为:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。结论 五种青钱柳提取物均有较强的体外抗氧化活性,且活性与浓度呈明显的量效关系。

[关键词] 青钱柳;提取物;脂质过氧化;自由基

文章编号:1003-1383(2009)04-0381-03

中图分类号:R 963

文献标识码:A

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal) Iljinskaya](CPS)又名青钱李(江西),系双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属植物,它是我国独有珍稀树种资源[1],分布于广西、江西、浙江等地的山区、溪谷或石灰岩山地,为广西特色植物。据《中国中药志要》记载,其树皮、树叶具有清热解毒,止痛功能,可用于治疗顽癣。长期以来民间用其叶片做茶,因其味甜有清热解暑、降糖、降压的功效,又称为甜茶,神茶等琜2]。青钱柳干叶的主要成分有糖、氨基酸、有机酸、黄酮、酸性物质、内酯、香豆精、三萜及皂甙、甾醇等[2]。我国从1970年开始对青钱柳进行药用开发研究,发现青钱柳具有明显的降血糖、降血压、减肥、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、清热解暑、提高人体免疫力、促进新陈代谢等多种功效,尤其对治疗糖尿病有显著疗效[3]。本实验对青钱柳不同提取物的体外抗氧化性进行了研究,为更进一步开发青钱柳保健产品提供理论依据。

材料与方法

1.动物 昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±2)g,由桂林医学院实验动物中心提供。

2.实验材料与仪器 青钱柳采自广西阳朔县白沙镇青钱柳基地,752睪W型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、FA2004电子天平(上海精科天平)、小型三用水箱(北京医疗设备厂)、XH睟型旋涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司)、LD0.8离心机(北京医用离心机厂)、旋转蒸发器(RE52型,上海亚荣仪器厂生产)。

3.试剂 丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、蒸馏水、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢均为分析纯,PBS液为自制。

4.实验方法

(1)青钱柳不同溶剂提取物的制备 取烘干过筛的青钱柳粉末,分别按固液比1∶20加入去离子水,用旋转蒸发器提取2 h,过滤,去残渣。滤液分两部分,一部分加入80%乙醇提取后再用水提取,利用水提醇沉淀法[4]用三氯醋酸去蛋白质后得到青钱柳多糖合物,另一部分加入80%乙醇,提取1.5 h,分别用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取,得正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物,最后剩余的为水提物。各提取物均用真空浓缩至膏状,并于40℃真空干燥,冷藏备用。

(2)CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 小鼠禁食12 h后摘除眼球放血处死,取肝,在0~4℃下用生理盐水制成5%肝匀浆。实验分为对照组(10%肝匀浆)、阳性组(VitC)和高、中、低3个剂量的青钱柳提取物组(10%肝匀浆和青钱柳不同溶剂提取物配液)。以硫代巴比妥酸法测定MDA含量,并计算抑制率:

抑制率(IR)=(对照组MDA-提取物组MDA)/对照组MDA。

(3)CPS对羟自由基的清除作用

采用亚铁离子催化过氧化氢产生(•OH)的方法。在样品管中加0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液1 ml,PBS 2 ml和1 ml样品,旋涡混合器混匀后,加0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 ml,旋涡混合器混匀后,加0.01%过氧化氢溶液1 ml,置恒温水浴中37℃保温1 h。反应液置比色皿中,于分光光度计中在536 nm测定吸光度As。用1 ml蒸馏水代替1 ml样品,测定吸光度为Ap。吸光度为Ab的管不加过氧化氢和样品,都以蒸馏水代替。按以下公式计算羟自由基的清除率(d%):d%=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100。

5.统计学处理 计量资料以均数±标准差(-潯廓s)表示,采用EXCEL统计软件以tЪ煅榻行统计学处理,以P<0.05为有统计学意义。

结果

1.CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 青钱柳各提取物对MDA的生成均有抑制作用,随着各提取物浓度增加,部分提取物的抑制率也会相应增高。五种提取物中对MDA抑制最强的为正丁醇提取物,在浓度为1.0 mg•ml-1时,对小鼠肝组织自发性MDA的抑制率大小为:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。见表1。

表1 CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响(-潯廓s,n=6)

组别浓度(mg•ml-1)MDA(nmol•mgprot-1)抑制率(%)

对照组 11.388 ±0.306

VitC1.06.831±0.221※40.0

正丁醇提取物0.18.826 ±0.405※22.5

0.56.522 ±0.385※42.7

1.05.646 ±0.363※50.4

水提物0.19.742 ±0.164※14.5

0.58.715 ±0.325※23.5

1.07.844 ±0.386※31.1

多糖合物0.18.652 ±0.368※24.0

0.56.788 ±0.386※40.4

1.07.257±0.383※36.3

乙酸乙酯提取物0.18.531 ±0.459※25.1

0.58.848 ±0.317※22.3

1.08.528 ±0.388※25.1

石油醚提取物0.19.284 ±0.315※18.5

0.57.488 ±0.243※34.2

1.07.081 ±0.571※37.8

注:与正常对照组比: ※P<0.01

2.CPS对羟自由基的清除作用 CPS对•OH有清除作用,且作用较强。特别是正丁醇提取物、水提物和多糖合物,最高清除率可高达80%以上。随着各提取物浓度的增加,对•OH自由基的清除率不断增大。但到了一定浓度,再增加其浓度,反而清除率有所降低。

半清除率(IC50)指清除率为50%时所需样品的浓度,根据不同浓度样品的清除率作曲线求出。所需浓度越低,表明半清除率越高,清除效果越好。通过计算所得IC50值,可比较各青钱柳提取物对羟自由基的清除率:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。见表2。

表2 CPS对•OH自由基的清除作用(-潯廓s,n=6)

观察项目水提物

石油醚提取物

正丁醇提取浓度(mg•ml-1)0.020.050.100.150.300.250.300.400.050.100.15

0.300.50

清除率(%)33.7±1.243.1±1.552.5±0.961.0±1.294.5±1.741.3±0.753.9±1.675.7±1.2

3.0±0.99.2±1.719.0±01.641.7±1.290.4±1.2

IC50(mg•ml-1)0.09

0.29

0.31

(续)表2

观察项目多糖合物

乙酸乙酯提取物

浓度(mg•ml-1)0.300.400.500.600.700.800.900.250.300.350.40

清除率(%)44.3±0.955.0±00.762.4±1.171.0±60.780.0±0.987.8±0.983.9±1.218.6±0.9

40.1±1.247.7±0.721.6±1.2

IC50(mg•ml-1)0.33

0.35

讨论

青钱柳为广西特有珍稀植物,对它的开发利用还十分有限,青钱柳既有明显的药理价值又具备一定的食品保健功能,进行工业化开发利用前景十分广阔。针对青钱柳叶中含有黄酮、多糖、内酯等多种有效成分,本实验提取了五种青钱柳提取物,考察青钱柳的体外抗氧化活性,为其药理作用提供科学依据。

脂质过氧化产物丙二醛等可导致人体细胞氧化损害、老化、致癌和动脉硬化等多种疾病。过氧化脂质大部分由肝细胞产生,其分解也主要在肝脏。MDA是过氧化脂质的主要降解产物,其含量可反映脂质过氧化的程度。故MDA的水平测定可用作检测抗过氧化作用。本实验结果表明,CPS可明显降低小鼠自发性MDA的生成,且活性与浓度有明显的量效关系。

羟自由基是反应药物抗氧化活性的重要指标。本实验利用Fenton反应产生羟自由基:H2O2+Fe2+=•OH+OH+Fe3+。Fe2+与邻二氮菲生成红色配合物,加入CPS后,减弱了•OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用,引起自由基的变化,通过测定其吸光度值的变化,推断CPS对•OH的作用。结果表明CPS对羟自由基有较好清除作用,是天然高效的自由基清除剂。

CPS较高的体外抗氧化活性可能与其中含有黄酮类化合物有关。黄酮类化合物具有的多酚结构,能提供活泼质子,与自由基结合成稳定的产物,因而有较强的抗氧化作用[5]。黄酮类成分具有保肝、扩冠、抗炎、降低血管脆性,解除痉挛,增强心脏收缩,还有一定程度的抗菌及抑制肿瘤细胞等作用。同茶叶相比,青钱柳黄酮类化合物含量相对较高,可作为这些物质的补充源[6]。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].第21卷.北京:科学出版社,1979,18-19.

[2]谢明勇,李 磊.青钱柳化学成份和生物活性研究概况[J].中草药,2001,32(4):365-366.

[3]柳板誉,梁彦兰.混交林中青钱柳生长规律的研究[J].江西农业大学学报,2004,26(3):381-385.

[4]王著禄,陈海生,郑钦岳,等.商陆多糖的分离和纯化[J].第二军医大学学报,1990,11(1):56.

[5]张培刚,郑鸿雁,昌有权,等.松针黄酮的体外抗氧化作用研究[J].食品科学,2005,26(9):506-508.

[6]谢明勇,王远兴,温辉梁,等.青钱柳中黄酮甙和维生素含量的测定[J].食品科学,2001,22(1):66-68.

(收稿日期:2009-05-18 修回日期:2009-07-15)

(编辑:梁明佩 英文审校:唐雄林)