VEGF在Ⅰ期非小细胞肺癌患者淋巴结表达及临床意义

徐兆华 李明武 胡世新 王 俊 孙 蔚

[摘要] 目的 通过检测I期非小细胞肺癌(NSCLC)患者淋巴结中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,确定微转移灶的存在及其与肿瘤复发、转移和预后的关系。方法 选择 1999～2007年大连市第五人民医院胸外科经过根治性手术(肺叶或全肺切除、系统性淋巴结清扫术)的常规病理检查证实为Ⅰ期NSCLC患者33例的246枚淋巴结。所有患者术前均未接受过放疗、化疗,均有详细完整的临床随访资料。本次研究采用LSAB免疫组化VEGF染色,进行光镜病理学检查。结果 33例患者246枚淋巴结中有10例(30.3%)患者的12枚(4.9%)淋巴结中VEGF阳性表达。有或无VEGF阳性表达的患者复发转移率差异有统计学意义(80.0% vs 26.1%,χ2=7.015,P=0.016),VEGF阳性表达患者的中位生存期显著短于VEGF 阴性表达者(21个月vs. 60个月,P=0.016);Cox单因素风险模型(P=0.004)和多因素风险模型(P=0.004)均显示存在淋巴结微转移的I期NSCLC患者预后不良。结论 VEGF免疫组化染色检测淋巴结微转移与I期NSCLC复发转移相关,有助于更加精确的分期,可以作为I期NSCLC患者根治术后的一个预后指标,并为其综合治疗提供理论依据。

[关键词] 非小细胞肺癌; 淋巴结; 微转移;血管内皮生长因子; 免疫组织化学

[中图分类号] R734.2[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2009)28-06-03

目前关于检测I期非小细胞肺癌(NSCLC)淋巴结微转移,评价其预后意义及其对综合治疗的指导意义研究较少。我们采用血管内皮生长因子(VEGF)作为微转移的标记物,检测I期NSCLC患者的淋巴结微转移灶。

1材料与方法

1.1病例选择的标准

选择1999～2007年大连市第五人民医院胸外科经过根治性手术(肺叶或全肺切除、系统性淋巴结清扫术)的常规病理检查证实为Ⅰ期NSCLC患者33例的246枚淋巴结。所有患者术前均未接受过放疗、化疗,均有详细完整的临床随访资料。男19例,女14例;平均年龄56岁(32～68岁)。组织学类型鳞癌16例、腺癌12例、腺鳞癌5例;病理分期Ia 15例,Ib 18例。

1.2LSAB法免疫组化染色

1.2.1主要试剂兔抗人VEGF-C抗体,VEGFR-3抗体和鼠抗人CD31抗体购自美国Santa Cruz公司,SP免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)。病理组织切片机(西德LEICA);生物组织摊片烤片机(国产CS-Ⅲ型);自动脱水机(国产TS-12型)。

1.2.2免疫组织化学染色步骤将石蜡包埋组织标本置于-4℃冰箱内,冷冻后取出,切成2张5μm 厚组织薄片,并置于多聚赖氨酸处理过的载玻片上,经摊片、烤片后进行VEGF免疫组织化学染色。将5μm 厚的石蜡切片常规脱蜡,逐级水化,先经3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,0.01mol/L 枸橼酸缓冲液行抗原修复,然后依次加入正常小牛血清(1∶10),VEGF-C(1∶100),CD31(1∶100),VEGFR-3(1∶200),生物素化羊抗鼠抗体(1∶200),SP 复合物(1∶200)。以上各步之间均经37℃恒温箱孵育30min,PBS冲洗(小牛血清除外),最后DAB染色,DAB显色:取lmL蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂1滴,混匀后加至切片,室温显色,镜下控制反应时间在5～30min之间,蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染;脱水透明,封片,待检。

1.2.3染色结果评判标准以细胞膜及细胞浆出现棕黄色显色为阳性。只要切片中见到一个VEGF染色阳性的细胞,就认为阳性,即淋巴结中有微转移灶的存在(本实验是在大连市第五人民医院病理科的协助下完成,参与实验操作及阳性细胞计数的2名病理医师均对患者的临床资料不了解)。

1.2.4实验对照以VEGF阳性表达的乳腺癌组织切片为阳性对照,以抗体稀释液PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.3统计学处理

本研究的所有数据均采用SPSS11.5软件包进行处理,其中百分比(率)差异性的比较采用Fishers精确卡方检验;Kaplan- Meier乘积限法计算生存率,并绘制生存曲线;Log-rank法比较生存期;Cox回归模型用于预后的单因素分析和多因素分析。所有数据统计结果以P<0.05为差异有统计学意义。生存患者和非肿瘤原因导致的死亡患者按删失值处理。随访方式包括门诊随访,电话随访及信件随访等。

2结果

2.1检测淋巴结中VEGF(+)细胞

我们采用了33例患者的常规组织病理检查阴性的淋巴结共246枚,其中发现12枚(4.9%)淋巴结VEGF染色阳性,10例(30.3%)患者淋巴结VEGF染色阳性。单个或成小细胞束的VEGF(+)细胞最常见于淋巴结的被膜下或髓窦处。见图1,2。

VEGF(+)细胞表达频率在性别、年龄、组织学类型、T分期中差异无统计学意义。

2.2微转移对复发转移的影响

截止到2007年4月最后一次随访,19例患者无瘤生存,14例患者出现复发转移,其中2例患者局部复发但尚生存,12例患者远处转移死亡,这些患者从手术到复发转移的中位间隔时间为21.5个月。10例淋巴结VEGF表达阳性的患者中8例(80.0%)复发转移,23例淋巴结VEGF表达阴性的患者中6例(26.1%)复发转移,二者之间比较差异有统计学意义(χ2=7.015,P=0.016)。

2.3微转移对生存期的影响

33例患者总的5年生存率为63.6%(21/33)。Kaplan-Meier生存曲线显示淋巴结中出现微转移的患者中位生存期显著短于未出现微转移的患者(21个月 vs 60个月,P=0.007)。

2.4单因素和多因素分析结果

单因素Cox风险模型显示病理分期及淋巴结微转移水平为预后的风险因素(P=0.004,相对风险系数=5.06)。

3讨论

一般而言,肺癌总的5年生存率为13%,病灶局限组为47%,区域性扩散组的5年生存率仅为17%,而远处转移组的5年生存率仅为1.7%[1]。由此可见,肺癌的转移与复发和其预后有着肯定的关系[2]。

1971年Fo1kman发现肿瘤细胞能释放一种能够诱导血管形成的物质,称之为血管形成因子(Tumor angiogenesis factor,TAF)[3]。1996年Hanahan[4]提出了“血管生成的开关平衡假说”,即新血管生成的整个过程受血管生成调节因子的严密调控,血管生成与否取决于血管生成的正性调节因子和负性调节因子之间力量的对比。目前已分离纯化了20多种正性调节因子及相关因子,如VEGF(血管内皮生长因子)、bPGF(碱性纤维母细胞生长因子)、aFGF(酸性纤维母细胞生长因子)、PD-KCGF (血小板源性内皮细胞生长因子)、TGF-β(转化生长因子β)等,其中以VEGF作用最强、特异性最高[5]。VEGF又名血管通透性因子(Vascular permeability factor,VPF),是1983年Senger等首先在豚鼠肿瘤腹腔渗液及多种肿瘤细胞培养液中发现,随后1989年Leung 等从牛垂体滤泡细胞培养液中分离出并加以证实[6]。OByrne等[7]报道VEGF与非小细胞肺癌肿瘤血管生成关系密切。

非小细胞肺癌与其他实体肿瘤一样,其生长和转移依赖瘤体内血管的形成。肿瘤血管形成不仅是肿瘤生长所必需,而且是肿瘤进展和转移的必需条件。肿瘤在经历生长缓慢的血管前期而进入血管期后,生长迅速,呈指数性生长,且新生毛细血管基底膜呈节段性分布,比正常组织的成熟毛细血管对瘤细胞有更高的亲和性,更加促进了瘤细胞向循环系统入侵,是远处转移的重要机制之一[8]。

肿瘤淋巴结微转移一般是指恶性肿瘤细胞在发展过程中,播散并存活于淋巴结中,尚未形成显性转移结节,转移部位也无任何临床表现,常规检查方法如影像学和临床病理学等均难以检测发现出一种微量转移特征。诊断淋巴结微转移的标准是在常规病理学检查为阴性的受检淋巴结中,经现代分子生物学技术诊断为阳性者或在免疫组化染色的淋巴结组织石蜡切片中出现散在的单个细胞或长度≤2mm 的肿瘤细胞束[9]。

我们的研究发现VEGF免疫组化染色检测淋巴结微转移与I期NSCLC复发转移相关,10例淋巴结中VEGF表达阳性的患者中8例(80.0%)复发转移,23例淋巴结中CK表达阴性的患者中6例(26.1%)复发转移,二者之间差异有统计学意义(χ2= 7.015,P=0.016)。

淋巴结微转移也与I期NSCLC预后相关:本研究中33例患者总的5年生存率为63.6%。Kaplan-Meier生存曲线显示淋巴结中出现微转移的患者中位生存期(21个月)显著短于未出现微转移的患者中位生存期(60个月,P=0.007)。单因素Cox风险模型显示T分期及淋巴结微转移水平均为预后的风险因素(P=0.045,0.004)。多因素Cox风险模(Backward:LR method)显示淋巴结微转移水平是I期NSCI C患者的独立预后因素(P=0.004)。

淋巴结微转移阳性的I期NSCLC患者较淋巴结微转移阴性的患者容易复发、生存期短。而目前分期未考虑淋巴结微转移的因素,故不能精确反映疾病的状态。到目前为止,对NSCLC的淋巴结(N)分期仍主要依赖于受检淋巴结的切片HE染色的结果。仅凭这种方法,那些隐藏在淋巴组织或淋巴窦中的单个肿瘤细胞或肿瘤细胞束,甚至一些较小的转移巢均很容易被遗漏掉,这就导致部分NSCLC患者的TNM分期过低,因此检测淋巴结微转移灶还有利于I期NSCLC的精确分期。

对I期NSCLC患者的治疗首选手术切除。对I期NSCLC术后是否需要辅助化疗,目前观点尚不一致。一般认为对I期NSCLC,局部控制是主要问题,单纯外科治疗就能达到根治的目的,没有必要应用辅助化疗。随着淋巴结微转移研究的深入,对微转移阳性的I期NSCLC患者根治术后实施辅助化疗的必要性越来越引人关注。Hamada等[10]对日本国内以优福定作为辅助化疗方案的9个随机试验(1923名I期NSCIC患者)进行Meta分析,结果为接受肺癌根治术+优福定辅助化疗组患者的5年、7年生存率(81.0%和76.5%)均高于单纯手术组患者(77.2%和69.5%,P=0.011,0.001),提示I期肺腺癌患者根治术后接受优福定辅助化疗可以提高5年、7年生存率。Berghmans等[11]对1965～2004年间以英文和法文发表的19个关于辅助化疗的随机试验进行Meta分析,结果表明对经过肺癌根治术的I期NSCIC患者进行辅助化疗,可以有效提高患者的生存期(HR 0.88,95%C1 0.48～1.93)。这为I期NSClC的综合治疗,尤其是淋巴结微转移阳性患者术后辅助化疗提供了理论依据。

[参考文献]

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[3] Folkman J. Angiogenesis in cancer,vascular,rheumatoid and other disease[J]. Nature Med,1995,1:27-31.

[4] Hanahan D,Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenric switch during tumorigenesis[J]. Cell,1996,86:353-364.

[5] Lund EL,Spang TM,Skovgaard PH,et al. Tumor angiogenesisa new t herapeutic target in gliomas[J]. Acta Neurol Scand,1998,97:52-62.

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[7] OByrne KJ,Koukourakis MI,Giatromanolaki A,et al. Vascular endot helial growth factor,platelet-derived endot helial cell growth factor and angiogenesis in non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer,2000,82(8):1427.

[8] Folkman J. Tumor angiogenesis[J]. Adv Canncer Res, 1985,43:175- 203.

[9] Passlick B, Pantel K. Kubuschok B, et al. Expression of MHC molecules and ICAM-1 on non-small cell lung carcinoma;association with early lymphatic spread of tunour cells[J]. Eur J Cancer,1996, 32A(1):141-145.

[10] Hamada C,Tanaka F,Ohta M,et a1.Meta-analysis of postoperative adjuvant chemotherapy with tegafurruracil in non-small cell lung cancer[J]. J Clin Oncol,2005,23(22):4999-5006.

[11] Berghmans T,Paesmans M,Meert AP,et al. Survival improvement in resectable non-small cell lung cancer with(neo) adjuvant chemotherapy:results of a meta-analysis of the Liteature[J]. Lung Cancer, 2005,49(1):13-23.

(收稿日期:2009-05-07)