Ｅ－选择素基因多态性与新疆哈萨克族原发性高血压的相关性研究

郑维威　郭清江　张丽翠　蔡伟娟　刘　旻　吴雪花　黄瑾　谢建新　周祖钊　何　芳　马雅静　程　江

【摘要】 目的 探讨E-选择素(E-selectin)基因第2外显子+G98T和第4外显子+A561C位点单核苷酸多态性在新疆哈萨克族人群中的分布，并分析E-selectin基因多态性与原发性高血压的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法，检测了新疆哈萨克族人群无血缘关系的150例原发性高血压患者和150名对照者E-selectin基因+G98T位点及+A561C位点多态性,同时用生化分析仪检测相关生化指标。结果 ①新疆哈萨克族人群中E-selectin基因+G98T多态性位点存在GG、GT二种基因型，其中以GG基因型发生频率最高(91.3%)，GT基因型频率次之(8.7%)；同时也存在AA、AC二种基因型，其中以AA基因型发生频率最高(88.0%)，AC基因型频率次之(12.0%)；②E-selectin AC基因型在高血压组和对照组间的分布差异存在显著性(χ²=5.31，P<0.025)。结论 新疆哈萨克族人群中存在E-selectin+G98T和+A561C两位点单核苷酸多态性，其中A561C基因多态性与原发性高血压具有相关性，C等位基因可能是新疆哈萨克族原发性高血压发病的遗传易感基因。

【关键词】 E-选择素; 基因多态性；哈萨克族；高血压

基金项目：新疆地方与民族高发病教育部重点实验室开放基金资助课题（项目编号：2005-07），石河子大学医学院第一附属医院资助课题（项目编号：2009-03）

作者单位：832003石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室(郑维威 郭清江 张丽翠 蔡伟娟 刘旻 黄瑾 谢建新 周祖钊 何芳);

石河子大学医学院第一附属医院检验科(郑维威 郭清江 张丽翠 蔡伟娟 刘旻 吴雪花 马雅静 程江);

石河子大学医学院生物化学与分子生物学教研室(黄瑾 谢建新 周祖钊);

石河子大学医学院病理生理学教研室(何芳)

Correlationof E-selectin gene polymorphisms in Xinjiang Kazak people with essential hypertension

ZHENG Wei-wei,GUO Qing-jiang,ZHANG Li-cui,et al.

Dept.of Clinical Laboratory,Shihezi University,Xinjiang 832008，China

【Abstract】 Objective To study the correlation of the +G98T polymorphism in the exon2 and the +A56lC polymorphisms in the exon 4 of E-selectin gene in Xinjiang Kazak people and the association with essential hypertension(EH). Methods Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) method was used to determine +G98T and S128R loeus mutation. Polymorphisms in E-selectin gene in 150 EH Patients and 150 controls. Automated Biochemieal Analyzer was used to measure the clinical biochemistry datas. Results ①Two genotypes AA and AC of E-selectin A561C polymorphisms，GG and GT genotypes of E-selectin G98T polymorphisms were found in Xinjiang Kazak people.②There was significant difference in frequencies of genotype in E-selectin A561C polymorphisms between essential hypertension and control group P<0.05.Conclusions E-selectin A561C amd G98T polymorphism exists in Xinjiang Kazak people. There is a correlation between E-selectin A561C polymorphism in Xinjiang Kazak people with essential hypertension.CAllele may be one of predisposing factor of Xinjiang Kazak people with essential hypertension.

【Key words】 E-selectin; Gene polymorphism;Kazak people; Hypertension

原发性高血压是一种多基因、多因素综合作用而导致的常见疾病,呈遗传易感性与环境因素相结合的发病模式。现研究热点围绕寻其相关基因展开,炎性反应与自身免疫是否为高血压的发病原因也引起了人们的关注。炎症细胞因子E-选择素(E-selectin) 及其部分基因多态性被证明与高血压相关,但E-选择素第4外显子A561C和第二外显子G98T基因多态性对高血压的影响报道不多,本文对其与新疆哈萨克族高血压的相关性进行了研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象 高血压组150例,男55例,女95例。来自新疆沙湾县相对闭塞的牧区，经过心血管科副主任医师确诊的高血压患者,并排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病。均符合1999年WHO的高血压诊断标准。对照组:150例,男55例,女95例。均为健康体检者,无高血压病家族史,并进行有关检查排除了高血压、心肌缺血、糖尿病等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂盒法抽提基因组DNA（试剂盒来自上海生工生物技术公司）,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性( PCR-RFLP) 方法进行DNA多态性分析。

1.2.2 引物设计与合成 提取人类基因组DNA,参考相关文献^［1，2］设计一对引物(引物由上海生工生物公司合成)。

1.2.3 PCR扩增 PCR 扩增体系为25 μl,模板DNA2 μl,上下游引物各0.7 μl,10 ×Buffer2.5 μl,Mg2+2 μl,dNTPs0.5 μl,Taq-DNA 聚合酶0.3 μl (以上均由上海生工生物公司提供) ,双蒸水补足至25 μl。应用英国Hybaid Express全自动PCR扩增仪,先94℃预变性5 min,94℃变性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸45 s,35个循环,最后72℃再延伸10 min。

1.2.4 限制性核酸内切酶酶切 PCR 扩增产物10 μl,PstⅠ、HphⅠ(由上海生工生物公司提供) 2 μl ,10×Buffer 2 μl,双蒸水补足至20 μl。37℃水浴5 h进行酶切反应。

1.2.5 电泳判断基因型及测序 酶切产物点样至含溴乙淀的3%琼脂糖凝胶,120 V,电泳40 min后,在紫外灯下检测照相,经美国Kodak凝胶成像系统观察片段电泳图。对各基因型抽样测序(送上海生工生物公司)核实基因型。

1.2.6 对照组及高血压患者临床生化指标检测 采用日立7170型全自动生化分析仪检测清晨空腹肘静脉血FBG、TG、TC、LDL 、HDL 、UA、CRE、ALT 等常规血液生化指标。定标物均为国外原装试剂，保证线性范围在控。

1.2.7 统计学方法 所有计量数据以均数±标准差（x±s）表示,计数资料以频数表示。采用SPSS 11.5 统计软件进行数据分析。Hardy-Weinberg 检验、OR 计算、基因频率之间的比较采用四格表χ²检验;不同基因型的动态血压差异采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

3 讨论

E-选择素(E-selectin)是黏附分子选择素家族主要成员之一,为细胞表面糖蛋白,分子量为115 kD,由589个氨基酸残基构成,仅表达于细胞因子活化的内皮细胞表面,它是体内的一种促炎细胞因子,参与多种白细胞，包括粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等以CD4⁺记忆性 T细胞亚群的黏附与聚集,它在免疫、炎性反应及动脉粥样硬化的形成过程中起着重要作用^［3,4］。E-selectin基因位于第1号染色体长臂上,为一段长13 kb、DNA序列,含14个外显子和13 个内含子。有研究证实 E-selectin基因第2 和第4 外显子分别存在G/T和A/C多态性,这两种多态性可能影响E-selectin基因表达和功能,并可能与心血管疾病有密切关系^［1,5］。

1994年德国学者Wenzel等^［6］首先证实E-选择素第4外显子基因中第561位碱基因腺嘌呤(A)P胞嘧啶(C)(A561C)的转换,导致其分子128位氨基酸由丝氨酸(Ser)变成精氨酸(Arg)(S128R),这种基因多态性的存在可能影响E-选择素基因表达和生物学功能,进而影响到体内E-选择素的生物学作用。研究^［7］还发现E-选择素水平与其基因型有关,含C等位基因者E-选择素水平高于含A等位基因者。由此猜测,E-选择素基因多态性可能影响其在内皮细胞上的表达,基因结构的改变可能带来蛋白质功能的变化。

近来研究证实循环中炎症细胞因子E-选择素浓度与血压有关,而且E-选择素Leu554Phe(L/F554)多态性、第2外显子G98T基因多态性也与血压有关联^［8］。这明确表明炎症细胞因子E-选择素可以对高血压产生影响。目前发现E-选择素第4外显子A561C基因多态性与非胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮的相关性^［9,10］。而且这种多态性已被证实与欧美白人CAD有关^［2］。E-选择素A561C基因多态性在控制了诸多混杂因素的作用后仍是T2DM并发CHD可能的独立危险因子^［9］。其机制可能与A561C等位基因参与调控内皮细胞表达E-选择素有关。通过基因型的检测筛查CAD的高危人群,将有助于早期发现和防治CAD及动脉粥样硬化。但其与高血压的相关关系罕见报道。

本文首次报道了新疆哈萨克族E-选择素第四外显子A561C基因多态性和第二外显子G98T多态性与原发性高血压的相关性。本研究发现,E-选择素A561C基因型构成比在高血压组与对照组之间有显著性差异（P<0.025）,即C等位基因发生高血压的风险性是A等位基因的2.063倍。但是E-选择素G98T基因多态性与新疆哈萨克族原发性高血压没有相关性，尚不能认为T等位基因是新疆哈萨克族原发性高血压的易感基因。

推测E-选择素A561C基因型对血压的这些影响,可能源于第561位碱基因腺嘌呤A/胞嘧啶C的转换,导致其分子128位氨基酸由丝氨酸变成精氨酸后,造成蛋白质功能的变化,进而影响E-选择素基因在内皮细胞上的表达和生物学功能。由于循环中炎症细胞因子E-选择素浓度与血压有关,因此E-选择素基A561C转换可能改变了E-选择素的分泌数量而导致高血压。由于E-选择素基因第四外显子编码E-选择素表皮生长因子样结构域,发生在这一区域的A56lC转换很可能会改变表皮生长因子样结构域,从而改变E-选择素分子介导的黏附作用。进一步由E-选择素的分泌数量和黏附作用的改变如何发展至高血压,目前尚无定论。现推测可能与微循环异常有关^［11］。研究表明,微循环的结构和功能的改变可能源于并促进血压增高。高血压时,小的阻力动脉出现结构改变与重塑,如管壁/管腔比值增大,不同血管床的毛细血管网变稀少。这些改变可通过增加外周阻力维持并促进血压的升高。有证据表明,在高血压时观察到的至少部分微血管的变稀薄与血管重构、微血管生成减少有关^［12-14］。而E-选择素影响着微循环的完整性,它在白细胞与内皮细胞间的相互作用已经得到公认。白细胞与内皮细胞间的黏附性增强反过来由于移动聚集的白细胞产生的大量细胞素和酶促产物的作用,可导致平滑肌细胞的重构等微血管改变。

在我国,对于E-选择素基因多态性的研究报道较少。本研究应用PCR-RFLP的方法检测了新疆哈萨克族E-选择素基因A561C、G98T的多态性。在我国新疆哈萨克族人群中A等位基因频率（89.7%）与德国（91.3%）^［15］、美国（84.6%）^［16］和英国（88.6%）^［9］没有太大的差异，但与我国北京地区(97.8%)^［17］、武汉地区(97.0%)^［18］则有显著性差异；G等位基因频率（95.7%）与我国武汉地区汉族人群（92.5%）^［18］没有显著性差异。说明E-选择素基因多态性分布在不同种族间存在差异。了解我国人群中E-选择素基因多态性的分布,不仅为进一步研究我国人群中高血压的发生发展与E-选择素基因多态性间的关系提供理论依据,也将有助于更深入地理解高血压在不同种族间所具有的不同发病率和临床特点的基因背景。E-选择素基因多态性与高血压的研究才刚起步,还有待进行大样本、多地域、多民族广泛深入的研究。

参考文献

［1］ Ellsworth DL, Bielak LF, Turner ST, et al.Gender and age dependent relationships between the E-selectin S128R polymorphism and coronary artery calcification. J Mol Med,2001,79:390-398.