Ｉｄ１ ｍｉＲＮＡ表达载体构建与转染乳腺癌细胞

许子志　王　川

【摘要】 目的 构建正义、反义Id1真核表达载体，并成功转染乳腺癌MDA-MB-231细胞系，筛选稳定表达细胞株。方法 设计针对Id1基因的mRNA效的干扰序列。将干扰序列插入pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR 表达载体，构建Id1 miRNA真核表达载体，脂质体转染法转染乳腺癌MDA-MB-231细胞系，杀稻瘟霉素筛选稳定表达的细胞株。结果 Id1 miRNA真核表达载体的构建后，经酶切及测序鉴定正确后。转染乳腺癌MDA-MB231细胞系。经过2周杀稻瘟霉素筛选，获得稳定表达的细胞系。经RT-PCR鉴定，转染Id1 miRNA真核表达载体的细胞系Id1表达水平低于对照组。未转染组与阴性对照转染组无明显差异。

【关键词】Id1； 真核表达载体； 乳腺癌

Construct the eukaryotic expression vector of Id1 miRNA and transfect into breast caner cell line

XU Zi-zhi,WANG Chuan.Institute of Tumor Disease, Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001,China

【Abstract】 Objective To construct the miRNA eukaryotic expression vector of Id1 and successfully transfect the MDA-MB-231 cell lines of breast cancer and finally select the stabilized expressed cells lines. Methods To design miRNA array of Id1 gene. to insert the target gene into pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR to construct the Id1 miRNA eukaryotic expression vector. The liposome infection protocol transfect the MDA-Mb231 cell lines of breast cancer. Use Blasticidin to select stabilized expressed cell lines. Results The method of RT-PCR helps to acquire the whole Id1 array for about 212bp long. After identifying by enzyme and measuring array, it transfect the MDA-MB231 cell lines of breast cancer. We acquire the stabilized expressed cell lines through 2W Blasticidin selection. As a result of RT-PCR identification, the level of Id1 of Id1 miRNA transfection cell lines is lowerer than that of the other two groups. While the level of Id1 is no difference between the negative control transfection cell lines and negative control cell lines group.

【Key words】 Id1；Eukaryotic expression vector；Breast cancer

Id1(Inhibition of DNA binding/differentiation)蛋白是一类具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构的分子，是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。Id1可与一类具有bHLH结构的转录因子结合形成无功能的异源二聚体，从而抑制下游一些包含有E-box(CANNTG)或E样序列的靶基因的转录，发挥其显性负性调节功能。干扰了DNA与bHLH的结合，抑制细胞分化，促进细胞增殖, 因此Id蛋白被认为是分化和DNA结合的抑制剂。在组织细胞的发育分化及增殖中发挥重要作用。

研究发现Id家族的蛋白在许多肿瘤中的表达是上调的^［1-4］，研究证实其参与肿瘤的发生，与肿瘤细胞的恶性转化、生长、浸润、转移相关^［4］。在某些恶性肿瘤中，有Id1蛋白的高表达，这种高表达与肿瘤的恶性度、侵袭性及新生血管的形成等成正比。该分子在基因表达调控、细胞增殖、肿瘤发生和血管生成方面可能具有中心性的作用。

1 资料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞MDA-MB-232细胞株购自上海雅培公司。pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR表达载体，载体试剂盒，BLOCK-iT miR RNAi select引物，DH5α感受态菌，阴性对照克隆甘油菌（Negative control），均购自invitrogen公司。大观霉素购自鲁抗制药公司。干扰序列及引物序列由invitrogen公司公司合成。质粒提取试剂盒购自 TAKALA公司。高纯度质粒提取纯化试剂盒（MIDI）购自Qiagen公司。Sc734-Id1单抗（兔源）和sc2007羊抗兔多克隆抗体购自Santa-Cruz公司。lipofectamine2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司。杀稻瘟霉素购自Invitrogen公司。RT试剂盒A3500购自PROMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 设计与合成 利用Invitrogen公司网上BLOCK-iT miR RNAi设计工具。对基因(ID：3397)的两个转录版本mRNA（NM-002165.2和NM-181353.1）都有效的干扰序列。经BLAST筛选得到4对micmRNA正反链核苷酸。由invitrogen公司公司合成。其中No.2，No.3对信息如下：No.2F TGCTGTTGAGGCGTGAGTAACAGCCGGTTTTGGCCA CTGACTGACCGGCTGTTTCACGCCTCAA；No.2R CCTGTTGAGGCGTGAAACAGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCTGTTACTCACGC CTCAAC；No.3FTGCTG AACTGAAGGTCCCTGATGTAGGTTTTGGCCAC TGACTGACCTACATCAGACCTTCAGTT；No.3R CCTGAACTGAAGGTCTGATGTAGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCTA CATCAGGGACCTTCAGTTC。

1.2.2 克隆步骤 oligo退火,连接,再转化:取5 μl连接液加入100 μl的DH5α感受态细胞中进行转化，最后将细胞涂布于含50 μg/ml壮观霉素的LB平板，平板倒置于37℃培养箱中过夜培养。阳性克隆PCR鉴定:从转化不同质粒感受态细菌的两组壮观霉素（50 μg/ml） LB琼脂平板挑取转化新鲜菌落，用质粒回收试剂盒抽提两组质粒行PCR鉴定，使用载体通用测序引物进行PCR，引物序列分别为：5′-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3′，5′-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3′。阳性克隆PCR产物约为250 bp，产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳后，在约250 bp处有一条相应的电泳条带，说明目的片段与载体正确连接。质粒抽提:取2 ml保留的阳性克隆菌液，用质粒抽提试剂盒进行抽提。对抽提的质粒进行测序验证。

1.2.3 分组转染乳腺癌细胞MDA-MB231细胞株及稳定转染细胞株的筛选

用Qiagen Tip100 Plasmid Midi 纯化试剂盒大量抽提高纯度质粒Id1-pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR、及阴性对照质粒（Negative control）。取所获DNA 5μl，60倍稀释，以紫外分光光度计测定OD260、OD280及比值，确定浓度及纯度。MDA-MB231乳腺癌细胞以含10%小牛血清的DMEM高糖培养液，于75 ml细胞培养瓶中，37℃；5%CO2；100%湿度，培养箱中培养。每3~4 d，传代一次。同时用不同浓度杀稻瘟霉素杀伤细胞以确定合适的药物筛选浓度（6 ng/L）。转染前1 d，选取处于对数生长期的细胞，用台盼蓝染色计算MDA-MB231细胞存活率，选用存活率大于或等于97%细胞,随机分组，使用Lipofectamine2000作为转染介质，将三组质粒（No.2 ,No.3及negative control）分别转染三组乳腺癌MDA-MB231细胞中。无血清培养液培养5 h。吸弃转染混合液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。37℃ 5%CO2 100%湿度培养箱中，培养48 h。弃上清，加入含6 μg/ml杀稻瘟霉素的DMEM高糖培养液。每3 d换液一次，直到多克隆细胞株出现。4周后，具有抗性的多克隆细胞株形成细胞团后，挑取阳性克隆至12孔板培养继续扩增，然后转种至75 ml细胞培养瓶继续培养。

1.2.4 重组质粒所编码的Id1RNA在乳腺癌细胞MDA-MB231细胞株中的表达与分析 实验分为四组；第一组为未转染组。第二三组为分别转染No.2,No.3组，第四组为转染negative control阴性对照载体的细胞克隆组，取出两组分别转染pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR； 空白Negative control质粒的细胞各一瓶，及未转染细胞一瓶，弃去细胞培养液，PBS洗三次。每个细胞培养瓶中加入Trizol裂解液 1 ml，细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温下放置5 min； 在EP管中，加0.2 ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15 s，在室温下放置2~3 min后，12 000 g（4℃）离心15 min； 取上层水相置于新EP管中,加0.5 ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下放置10 min,12 000 g（4℃）离心10 min；弃上清， 1 ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7 500 g（4℃）离心5 min，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。以紫外分光光度计测定OD 260、OD 280及比值，确定浓度及纯度。采用逆转录试剂盒（Promega公司，A3500）合成cDNA，配制20 μl反应体系：RNAsin 20 U，Oligo (dT) 150.5 μg，RNA模板1.5 μg，逆转录缓冲液1 mmol/L，AMV反转录酶15 U，dNTPs 1 mmol/L，MgCl2 25 mmol/L，混匀后42℃反应1 h，95℃ 5 min，4℃放置10 min。PCR反应体系50 μL：模板cDNA（约50 ng），上、下游引物（各50 pmol/L）引物序列分别为：5′-GCAAGGTGAGCAAGGTGGAGATTC-3′，5′-GCTTCAGCGACACAAGATGCGATC-3′ 212 bp。，94℃ 4~5 min，立即冰浴，瞬时离心，加入PCR缓冲液（4.8 μl），MgCl2（3.8 μl），dNTPs（0.9 μL），Taq酶（Promega公司，M1661） 2.5 U，最后加无核酸酶的水定容为50 μl。反应条件为: 95℃预变性5 min，94℃ 60 s, 56℃ 60 s，72℃ 60 s，30个循环。 PCR产物5 μl经20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

2 结果

2.1 阳性克隆PCR鉴定PCR产物电泳图谱：

M：marker 1~4: No.15~8: No.29~12: No. 313~16: No.4

阳性克隆PCR产物约为250 bp，产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳后，在约250 bp处有一条相应的电泳条带，说明目的片段与载体正确连接。

2.2 重组质粒的序列测定 经上海生工生物工程技术公司测序，送检序列与同合成序列相符，载体构建成功。

2.3 转染后绿荧光蛋白表达

2.4 在重组质粒Id1-pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体的细胞克隆中，重组的目的基因包含ID1 miRNA序列，可表达Id1 miRNA，抑制细胞克隆中的Id1 RNA表达水平。

A．无转染组B.转染No.2组C.转染No.组D. negative control阴性对照转染组 M:Marcker

结果证实两组转染载体的细胞克隆中Id1表达与其他组不相同。稳定表达重组质粒Id1-pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体No.2，No.3的两组细胞克隆中Id1RNA的表达水平降低；整合negative control阴性对照载体的细胞克隆中Id1RNA的表达水平与无转染组相似。

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。且近年来发病率有逐渐上升的趋势。乳腺癌的浸润，转移是导致许多女性死亡的重要原因。现研究发现Id1过度表达与乳腺癌发生、发展、浸润、转移关系密切。

HLH转录因子是调节细胞生长和分化的重要因子，大多数HLH蛋白属于碱性HLH(bHLH)家族成员，包括高度保守的HLH结构域和碱性DNA结合区。HLH结构域使这些蛋白形成特定的同源或异源二聚体，从而获得转录活性。DNA结合区通过与E盒序列结合发挥转录激活或抑制作用。Id分子通过竞争性的抑制其他bHLH家族成员转录激活的功能。从而负向调控基因表达与细胞分化，促进肿瘤的发生，增殖、去分化、侵袭、转移等生物学行为。ID1的异常表达可诱导乳腺癌细胞持续增殖，当下调Id1表达时可导致细胞周期素cyclin D1和cyclin E的表达下降，和cyclin E-cdk2活性降低，以及PRB的ser780位点的磷酸化程度降低，从而促进细胞周期进程，诱导肿瘤细胞增殖^［5］。Id1过表达与乳腺癌转移相关，在早期乳腺癌中Id1通过cyclin D1来促进癌细胞增殖^［6］，在肿瘤侵袭和转移过程Id1能通过促进基质金属蛋白酶（MMP）的活性促进肿瘤细胞的侵袭、转移。Id类蛋白还可能通过诱导肿瘤新生血管的形成而参与肿瘤细胞的侵袭、转移。在ER阴性或弱阳性的乳腺癌中肿瘤中微血管密度与Id1过表达相关^［7］。Id1可与Ras通过抑制细胞衰老来诱导乳腺癌转移^［8］，Gupta GP, Perk J等研究表明Id1与ID3在三阴性乳腺癌来群的恶性行为中起重要作用^［9］，Id家族成员具有一些癌蛋白的属性^［10］。研究表明Id蛋白特别是Id1，可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳动物细胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增殖所必需的关键因子^［11］。

Id1分子与乳腺癌的密切关系，可能对乳腺癌的早期诊断和治疗提供新的靶点。本实验成功构建Id1 miRNA真核表达载体，并成功转染乳腺癌MDA-MB231细胞株，筛选出稳定表达Id1蛋白的乳腺癌细胞株，为将来进一步研究他们之间的生物学行为差异，或详细了解其分子作用机制奠定了基础。

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