毛冬青中三萜皂苷类化合物的NMR归属*

张翠仙，杨金燕，林朝展，赵钟祥，冯育林，曾陇梅，祝晨蔯

(1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州510006；2.江西中医学院中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006；3. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州510275)

毛冬青为冬青科(Aquifoliacae)冬青属(IlexL.)植物毛冬青IlexpubescensHook. Et. Arn.的干燥根，是我国岭南地区习用中药。具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，临床上广泛应用于治疗冠心病、心绞痛和脉管炎等疾病，疗效确切[1-2]。前期药理活性研究表明毛冬青总三萜皂苷具有明显降低血浆粘度的作用。在此指导下，对其乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行深入研究，经理化性质及波谱方法鉴定，并与文献对照[3-4]，确定其结构分别为ilexsaponin B1(1)和ilexsaponin B2(2)(图1)。本文首次采用2D二维NMR技术对分离得到两个三萜皂苷的NMR信号进行归属。

图1 化合物1和2的结构图

1 结果与讨论

化合物1，白色针晶，θmp246～247 ℃。Liebermann-Burchard和Molish反应呈阳性。FAB-MS，m/z799 [M+H]+，结合1H NMR、13C NMR及DEPT谱(表1，7个甲基、11个亚甲基、15个次甲基和8个季碳)确定分子式为C41H66O15，不饱和度为9。NMR显示1具有1个孤立羧羰基[δC180.7(s)]，1个双键[δC128.1(d), 139.9(s)和δH5.65(br s，1H)]，除此外无任何其他不饱和信息，暗示1为五环三萜皂苷类化合物。NMR还显示该化合物结构中具有2个连氧亚甲基[δC66.7(t), 62.6(t), δH3.70(m, 1H), 4.31(m, 1H), 4.45(m, 1H), 4.52(m, 1H) ]8个连氧次甲基[δC88.8 (d), 83.1(d)，78.3(d), 71.5(d), 77.0(d), 78.0(d), 70.9(d), 77.9 (d)；δH3.25(dd, 2H, 11.2, 4.0), 4.50 (m,1H) 3.93 (m, 1H) 4.37 (m, 1H), 4.12 (m1H), 4.25 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 4.29 (m, 1H)]和1个连氧季碳[δC73.4(s) ]。HPLC-ESI-MSn给出m/z821 [M+Na]+，659 [M+Na-162]+，527 [M+Na-162-132]+暗示化合物1可能含有1个分子葡萄糖和1个分子木糖。同时1H NMR数据显示有两个端基质子信号δH4.84 (d, 1H,J=5.2 Hz)和δH5.38 (d, 1H,J=7.6 Hz)(图2)，表明1为二糖五环三萜皂苷。

图2 化合物1，2的1H-1HCOSY和主要HMBC相关

将化合物1进行酸水解[4]，糖的GLC分析结果表明(表2，3)，两个糖分别为D-木糖和D-葡萄糖。HMBC中δH4.84 (H-1′)与δC88.8(C-3)，δH5.38 (H″-1)与δC83.1 (C′-2)之间的相关，表明该糖链与苷元的C-3位相连，二糖之间1→2 (Glc 1→2 Xyl-)连接。将1的1H和13C NMR数据与文献[3-4]对照一致，确定其为ilexsaponin B1。

表1 化合物1，2苷元的13C NMR 数据

表2 化合物1,2苷元的1H NMR数据 (δH， J/ Hz)1)

表3 化合物1，2糖基部分NMR数据1)

化合物2，白色针晶，θmp240～241 ℃。Liebermann-Burchard和Molish反应呈阳性。FAB-MS，m/z945 [M+H]+，结合1H NMR、13C NMR及DEPT谱(8个甲基、11个亚甲基、20个次甲基和8个季碳)确定其分子式为C47H76O19，不饱和度为10。1H NMR谱数据显示有三个端基质子信号δH4.91(d, 1H,J=6.8 Hz)，5.82(d, 1H,J=7.5 Hz)，6.42(br s, 1H)。HPLC-ESI-MSn给出m/z967 [M+Na]+，821 [M+Na-146]+，659 [M+ Na -146-162]+，527 [M+ Na -146-162-132]+，表明该化合物为三糖五环三萜皂苷。比较2和1的NMR数据，二者数据相似，只是2又多了一个甲基五碳糖基信号[δH6.42(br s,1H), 4.78(m,1H), 4.70(m,1H), 4.34(m,1H), 5.02(m,1H), 1.80(6.0, d, 3H)和δC102.1(d), 72.4(d), 72.6(d), 74.4(d), 69.6(d), 19.0(q)]。

同样将2进行酸水解[4]，糖的GLC分析结果表明D-木糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖存在。HMBC中δH4.91(H-1′)与δC89.6(C-3)、δH5.82(H″-1)与δC79.1(C′-2)及δH6.42 (H-1″′)与δC79.5 (C″-2)之间的相关关系，证实此三糖连接顺序为1→2(Rha 1→2 Glc1→2 Xyl -)连接，并且位于苷元的C-3位。将2的波谱数据与文献[4-5]对照一致，确定其为ilexsaponin B2。

药理活性研究表明：毛冬青总皂苷明显降低小鼠血浆黏度，说明具有很好的心脑血管疾病的应用前景。同时体外生理活性试验研究表明，三萜类化合物具有抗寄生虫活性和溶血活性。而且具有28位游离羧基的五环乌苏烷型三萜类化合物具有很好的抑制锥体虫活性[7]。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂及药材

北京泰克光学仪器厂X-6型熔点仪；英国VG公司ZAB-HS双聚焦磁质谱仪；美国Finnigan公司LCQDECAXP高效液相色谱—质谱联用仪；瑞士Bruker公司 AVANCE AV 400超导核磁共振仪。层析硅胶(200～300目)为青岛海洋化工厂产品；溶剂和试剂均为广州化学试剂厂分析纯。

实验药材购自广州致信中药饮片有限公司，经祝晨蔯研究员鉴定为冬青科植物毛冬青IlexpubescensHook. Et. Arn.的干燥根，样品保存于广州中医药大学中药学院中药质量分析研究室(编号MDQ2001-1)。

2.2 提取与分离

毛冬青根(10 kg)，粉碎，用30 Lφ=30%乙醇，于室温下浸提5次。将提取液合并，减压浓缩得棕褐色黏稠膏状物(1.6 kg)。浸膏加水分散后依次用乙酸乙酯、正丁醇分配萃取，萃取液减压浓缩，乙酸乙酯部位得到棕褐色浸膏(396 g)。将乙酸乙酯部位用硅胶(200～300目)柱减压柱层析，洗脱剂采用逐渐增大极性的石油醚-乙酸乙酯体系、乙酸乙酯-甲醇体系洗脱。石油醚-乙酸乙酯(体积比为0∶100)洗脱剂洗脱得化合物1(2.7 g)；乙酸乙酯-甲醇(体积比为80∶20)洗脱剂洗脱得化合物2(1.8 g)。

2.3 化合物1和2的酸水解

化合物(1和2各5 mg)用φ=9% HCl水溶液在90 ℃条件下水解5 h，反应结束后冷却。反应液冷冻干燥，用吡啶溶解，添加氯化L-半胱氨酸甲基酯，在60 ℃条件下硅醚化，反应液离心后取上清液用GLC检测。

2.4 化合物的物理常数和波谱数据

ilexsaponin B1(1)，白色针晶，θmp246～247℃。FAB-MS，m/z799 [M+H]+，HPLC-ESI-MSnm/z821 [M+Na]+，659 [M+Na-glc]+，527 [M+Na-glc-xyl]+;1H NMR 和13C NMR (D6-pyridine) 见表1, 2和3。

ilexsaponin B2(2)，白色针晶，θmp240～241 ℃。FAB-MSm/z945 [M+H]+，927 [M+H- H2O]+; HPLC-ESI-MSn,m/z967 [M+Na]+，821 [M+Na-rha]+，659 [M+ Na -rha-glc]+，527 [M+ Na -rha-glc-xyl]+;1H NMR和13C NMR (D6-pyridine) 见表1, 2和3。

参考文献：

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