水飞蓟宾琥珀酸单酯的合成及其保肝活性研究

朱　琳　李金柱　卞惠敏　秦　凯　李　伟

（南京中医药大学 中医药研究院，江苏 南京 210029）お

摘 要：将水飞蓟宾进行衍生化，制备水溶性衍生物。水飞蓟宾与丁二酸酐在碱性条件下反应，生成水飞蓟宾-3,23-二琥珀酸单酯和水飞蓟宾-3-琥珀酸单酯，其结构经UV、IR、1H-NMR和MS波谱确证。在本反应条件下，可以选择性地对水飞蓟宾分子中的醇羟基进行酯化，制得水溶性好的衍生物。对产物进行抗急性干损伤的研究，产物可降低ALT活性，对CCl4致小鼠急性肝损伤具有保护作用。

关键词：水飞蓟宾；水飞蓟宾-3,23-二琥珀酸单酯；水飞蓟宾-3-琥珀酸单酯；保肝活性

中图分类号：R284文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0046-03オ

水飞蓟宾是水飞蓟素中的主要成分(占60%～70%)和重要的有效成分^[1]，在临床上作为肝保护剂而被广泛使用^[2]。但由于其溶解性太差，几乎不溶于水和油脂，口服吸收差，生物利用度低，从而影响了其临床疗效^[3]。

水飞蓟宾的结构(图1)最早由Pelte和Hansel在1975年通过降解的方法确定^[4]，对水飞蓟宾的衍生物制备研究开展的很广泛，主要的目的都是改善水飞蓟宾的药代动力学特征，增大其水溶性以改善其吸收。

本文的目的是对水飞蓟宾3,23-位进行结构改造，得到具有羧基的衍生物，以便将其制成水中溶解度较好的钠盐，实现注射给药。

1 合成部分

1.1 仪器与试剂

Waters2690高效液相色谱仪；BUCHI B-450型熔点测定仪；Bruker AV-500型核磁共振仪；水飞蓟宾，辽宁盘锦格林恩生物资源开发有限公司；其它试剂均为分析纯，南京化学试剂有限公司。お

1.2 合成路线

1.3 合成方法

在50mL圆底烧瓶中加入丁二酸酐0.3g(3mmol)、氢氧化钠0.04g(1mmol)、四氢呋喃30mL，室温搅拌1h后，加入水飞蓟宾0.24g(0.5mmol)，继续室温搅拌3h，硅胶拌样，挥干溶剂后，低温干燥，用硅胶(100～200目)柱层析分离纯化，以CH₂Cl₂-CH₃OH(80∶1～40∶1)梯度洗脱，硅胶(GF₂₅₄)薄层色谱检测，以CHCl₃-CH₃OH-CH₃COOH (20∶1∶0.5)为展开剂，紫外灯254nm下检视。收集溜份，减压蒸去溶剂，得到两个产物，干燥，得水飞蓟宾-3,23-二琥珀酸单酯(化合物1)0.15g和水飞蓟宾-3-二琥珀酸单酯(化合物2)0.12g，产率分别为51.8%和35.3%。

化合物1：

水飞蓟宾-3,23-二琥珀酸单酯；白色固体mp:115~117℃; UV(MeOH)λmaxnm: 283,232; IR(KBr)cm-1: 3416(OH), 2925(CH2), 2370, 2335, 1737(C=O), 1641(ArH), 1512(ArH), 1465(ArH), 1371(CH₃), 1276(O-Ar), 1161, 1086, 1030, 997, 827, 644. 1H-NMR(500Hz, DMSOδ ppm): 12.20 (2H, br, 2×-COOH), 11.42(1H, s, 5-OH), 10.99(1H, s, 7-OH), 9.19(1H, s, 20-OH), 7.17 (1H, d, J=2.0Hz, 13-H), 7.07-6.96(m, 15-H, 16-H, 18-H), 6.87(1H, dd, J=8.2, 1.8Hz, 22-H), 6.81(1H, d, J=8.2Hz, 21-H), 5.96(1H, d, J=2.2Hz, 6-H), 5.90-5.94(2H, m, 8-H, 2-H),5.53 (1H, d, J=11.6Hz, 3-H), 4.95(1H, d, J=8.0Hz, 11-H), 4.51(1H, m, 10-H), 4.12 (1H, m, 23a-H), 3.95 (1H, dd, J=12.2Hz, 4.6Hz, 23b-H), 3.78(3H, s, 19-OCH₃), 2.38-2.64(8H, m, 2×-CH₂CH₂-)

化合物2：

水飞蓟宾-3-琥珀酸单酯白色固体；mp: 169~172℃; UV(MeOH)λmaxnm: 285,232; IR(KBr)cm^-1: 3421(OH), 2925(CH₂), 2640, 1714(C=O), 1640(ArH), 1511(ArH), 1424(CH₂), 1378(CH₃), 1277, 1163, 1088, 1031 828, 641; 1H-NMR (500Hz, DMSOδ ppm)： 12.23(1H, br, 3-COOH), 11.5 (1H, s, 5-OH), 11.1(1H, br, 7-OH), 9.20(1H, s, 20-OH), 7.20 (1H, d, J=1.8Hz, 13-H), 7.03-7.09 (1H, m, 15-H, 16-H, 18-H), 6.94 (1H, J=8.2 Hz, 1.8Hz, 22-H), 6.88(1H, d, J=8.2Hz, 21-H), 6.03 (1H, d, J=2.1Hz, 6-H), 6.01-5.96(2H, m, 8-H, 2-H), 5.58 (1H, d, J=11.6Hz, 3-H), 4.99(1H, d, J=8.0Hz, 11-H), 4.26(1H, m, 10-H), 3.86(s, 3H, 19-OCH₃), 3.64(1H, m, 23a-H), 3.43(m, 1H, 23b-H), 2.47-2.72(4H, m, -CH₂CH₂-)

2 保肝活性研究

由于化合物1和2均为含羧基的水飞蓟宾衍生物，因此考虑将化合物1和2分别制成水溶性较好的钠盐，并通过尾静脉给药方式考察化合物1和2的保肝作用。

2.1 材料及方法

2.1.1 材料

甘利欣注射液：10mL/50mg，江苏正大天晴药业股份有限公司，批准文号：国药准字H10940190。

水飞蓟宾-3,23-二琥珀酸单酯(SD), 纯度95.00%;水飞蓟宾-3-二琥珀酸单酯(SS), 纯度99.09%。

SD给药量高剂量为91.0mg/kg，低剂量为45.5 mg/kg，SS高低剂量根据化合物1等摩尔浓度分别配制。

配置方法：分别称取化SD 455.1mg、227.5mg SS（纯度99.09%）388.9mg、194.4mg至50mL容量瓶中，加10%的氢氧化钠溶液溶解，并用10%盐酸调节pH=7，加0.9%NaCl溶液稀释至20mL。临用前用0.2μm微孔滤膜过滤除菌。

四氯化碳，批号20071008，上海久亿化学试剂有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT)检测试剂盒，批号20071217，南京建成生物工程研究所；天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒，批号20071217，南京建成生物工程研究所。

2.1.2 主要仪器

UV 754-型紫外可见光分光光度计，上海第三分析仪器厂；LD25-2型离心机，北京医用离心机厂。

2.1.3 实验动物

昆明种小鼠，雄性，体重(20.0±2.0)g，南京中医药大学实验动物中心。

2.1.4 实验方法

小鼠急性CC14肝损伤模型的建立：将CCl4于色拉油中超声溶解制成5%的溶液。正常对照组仅腹腔注射色拉油20mL/kg，其它各实验组小鼠按20mL/kg腹腔注射5%CC14色拉油溶液，禁食，不禁水。

2.1.5 动物分组及药物处理^[5]

将小鼠随机分为7组，即正常组（尾静脉注射生理盐水）、模型组（尾静脉注射生理盐水）、阳性药物组（0.5%甘利欣注射液100mg/kg）、SD（高剂量）组（91.0mg/kg）、SD钠盐溶液（低剂量）组（45.5mg/kg）、SS（高剂量）组（77.6mg/kg）、SS（低剂量）组（38.8mg/kg）。正常组10只，其余各组15只。给药组每天按设定剂量尾静脉注射给药2次，上午、下午各1次；空白组与CCL₄模型组给予等量的溶媒（生理盐水），第1天上午给药1h后，腹腔注射给予5%的CCL₄色拉油溶液，空白组腹腔注射给予等量的溶媒（色拉油），下午给药后禁食不禁水，第2天上午给药1h后取血，3000r/min离心10min，分离血清， 应用丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒，在754-型紫外可见分光光度计505nm处测定吸收度，计算血清ALT、 AST值，第3天下午给药后禁食，不禁水，第4天上午给药1h后取血，ALT、AST值测定方法同上。

2.2 实验数据统计

数据用±s表示，采用SPSS 11.0软件进行统计处理,两均数间比较进行t检验。

2.3 结果

24h ALT、AST活性的变化见表1，72h ALT、AST活性的变化见表2。

结果显示，造模24h后，模型组与正常组比较动物血清ALT、AST值升高（P<0.01）；甘利欣对照组与模型组相比较ALT、AST值没有变化；SS高剂量组与模型组比较动物血清ALT值降低（P<0.01），AST值降低（P<0.01）；SD低剂量组动物ALT值降低（P<0.05）。各组小鼠均无死亡。造模72h后，模型组与正常组比较ALT、AST值升高（P<0.01）；甘利欣对照组与模型组比较ALT、AST值降低（P<0.01）；药物组与模型组比较ALT、AST值均没有降低。造模72h后，甘利欣组和模型组均死亡率相同，SD和SS相比甘利欣和模型组死亡率均下降。

注：*（P<0.01），**（P<0.05）。

3 讨论

两个产物分别在水飞蓟宾的3位和3，23位与丁二酸酐酯化得到，说明醇羟基比酚羟基更活泼，容易与丁二酸酐发生反应。所合成化合物1钠盐和化合物2钠盐均能降低四氯化碳急性肝损伤小鼠的血清ALT值，表明化合物1钠盐和化合物2钠盐对受损及处于受损的肝细胞有保护和修复作用。

参考文献：

［1］ Hikinl H,Kiso Y,Wagner H,etal.Antihe patotoxi cactions of flavonolignans form Silybum marianum fruits［J］.PlantaMed,1984,50(3):248-250.

［2］ 任孟军,左国庆,何松.水飞蓟宾对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ2增殖的影响及其机制研究［J］. 重庆医学,2005,34(3):369-372.

［3］ 肖莉, 靳淑敏, 张丽霞，等. 水飞蓟素制剂及其应用进展［J］. 中国药物与临床,2005,5(3):205-208.

［4］ Pelter, Andrew Hansel, Rudolf. Structure of silybin. I. Degradative experiments［J］. Chemische Berichte, 1975, 108 (3): 790-802.

［5］ 杨错, 刘玉兰, 张红梅.柴胡乳剂对急性化学性肝损伤的保护作用［J］.沈阳药科大学学报，2006，23(2): 105-108.

（责任编辑：姜付平）