青蒿琥酯对肝纤维化小鼠细胞外基质的影响

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(广州中医药大学 测试中心，广东 广州 510405)

近年研究表明，青蒿琥酯具有抗肝纤维化的作用[1]，本文采用CCL4致小鼠肝纤维化模型，观察青蒿琥酯对纤维化小鼠肝脏损伤的干预作用，以期探讨青蒿琥酯抗肝纤维化的作用机理。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物 同龄SPF级昆明小鼠60只，雌雄各半，体重18～22 g。由广州中医药大学实验动物中心提供，小鼠许可证号：SYXK(粤)2003-0001，粤监证字：2007A013。

1.2 试剂及药品 四氯化碳(天津市耀华化学试剂有限责任公司生产，批号：20061006)，青蒿琥酯(纯度99.99%，广西桂林制药厂，批号030802)，将青蒿琥酯用5%NaHCO3溶解成12 g·L-1的储备液，每次实验前配制成所需浓度，秋水仙素(广州威佳科技有限公司提供，批号：20070329)，苯巴比妥钠注射液(广东邦民制药厂有限公司 批号060913)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 将60只小鼠随机分为5组，每组12只，分别为正常组、模型组、青蒿琥酯低剂量组(治疗Ⅰ组)、青蒿琥酯高剂量组(治疗Ⅱ组)、秋水仙碱组(对照组)。

1.3.2 造模及治疗 模型组和用药组动物按0.005 mL/g体重，皮下注射20%CCL4花生油溶液，每周二，五注射共2次，注射后1 h给予药物灌胃，青蒿琥酯低剂量组0.014 4 mg/g体重，青蒿琥酯高剂量组0.028 8 mg/g体重[2]，秋水仙碱10-4mg/g体重，正常组和模型组生理盐水灌胃0.05 mg/g体重。同时在模型组和用药组饮用水中每250 mL加1支苯巴比妥钠。

1.4 实验试剂及方法

1.4.1 试剂配制 (1)Masson复合染色液：酸性复红1 g，丽春红2 g，桔黄G 2 g，0.25%醋酸300 mL。(2)苯胺蓝染色液：苯胺蓝1 g，加入100 mL蒸馏水。

1.4.2 方法 Masson三色染色法

1.5 实验步骤 (1)10%中性多聚甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。(2)Masson复合染色液5min。(3)0.2%醋酸水溶液稍洗。(4)5%磷钨酸5～10 min。(5)0.2%醋酸水溶液浸洗2次。(6)苯胺蓝染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次。(7)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。

1.6 图像分析 应用EMAIL-200病理图象分析软件，对Masson染色间质胶原进行测量。测量内容：观察每100×视野下纤维间隔平均数目和纤维间隔的平均厚度(um)。每个切片观察5个视野，取平均值。

2 结果

正常组，肝小叶结构完整，图中可见中央静脉和汇管区及肝板结构无破坏，无纤维间隔形成(图1)。模型组，肝组织中有假肝小叶形成，窦周隙明显增宽，肝小叶间纤维间隔明显增宽，中央静脉和汇管区的结构遭到一定程度的破坏(图2)。用药Ⅰ组(青蒿琥酯低剂量组)，肝组织中有假肝小叶形成，窦周隙和肝小叶间的纤维间隔较宽，但比模型组有所好转(图3)。用药Ⅱ组(青蒿琥酯高剂量组)，肝小叶间有纤维间隔形成，窦周隙较宽，但比模型组、用药Ⅰ组和对照组要明显好转(图4)。对照组(秋水仙碱组)，肝组织中有假肝小叶形成，窦周隙和肝小叶间的纤维间隔较宽，但比模型组要有所好转(图5)。各组小鼠肝组织纤维间隔数目和纤维间隔宽度见表1。

图1 正常组 图2 模型组 图3 用药Ⅰ组 图4 用药Ⅱ组 图5 对照组

表1 各组小鼠肝组织纤维间隔数目及宽度比较

3 讨论

结缔组织广泛分布于人体和动物体内，其结构特点是细胞分散，有大量的细胞间质纤维和基质，而化学成分是含有大量的蛋白质和多糖。Masson三色染色法是常用的显示细胞外基质的染色法，本染色法用苯胺蓝代替常用的亮绿，镜下可见细胞外基质为蓝色。我们已经通过HE染色和电镜证实青蒿琥酯对肝小叶及肝细胞有很好的保护作用，并能够明显减少胶原的形成，防止血窦毛细血管化的作用[3]。本文采用特殊染色法来进一步证实青蒿琥酯对细胞基质形成的作用，正常小鼠肝组织的细胞基质较少，因此在正常组镜下发现肝小叶的结构很难区别，但在模型组由于胶原的增多，形成了明显的蓝色纤维间隔，青蒿琥酯高剂量组具有明显降低基质中纤维间隔数目和宽度的作用(P<0.01)。镜下很容易区别肝小叶，甚至发现有假小叶形成，并且发现肝板间的结构明显增宽，而用药Ⅰ组(青蒿琥酯低剂量组)、用药Ⅱ组(青蒿琥酯高剂量组)和对照组的纤维间隔相对模型组要有所改善，因此认为青蒿琥酯具有明显抑制细胞外基质形成的作用。

[1]来丽娜,方步武.青蒿琥酯抗牛血清白蛋白免疫性大鼠肝纤维化作用的研究[J].中药药理与临床,2006,22(3、4):35-36.

[2]方步武,来丽娜,林雅军,等.青蒿琥酯抗四氯化碳致大鼠肝纤维化的作用[J].中国药理学通报,2005,21(6):762-3.

[3]刘金元.青蒿琥酯对实验性肝纤维化小鼠形态学的影响[J].江西中医学院学报,2008,20(5):70-71.