益气健脾法对脾虚证大鼠模型骨骼肌线粒体ATPase活性的影响

曾益宏，刘友章，徐 升

(1.广州中医药大学第一附属医院,广东 广州 510405；2.安徽省中医院,安徽 合肥 230031)

“脾主肌肉”是脾的重要功能之一，《素问·痿论》：“脾主身之肌肉”，《素问·五脏生成篇》：“脾之合肉也”。而“脾主肌肉”是以脾主运化的功能作为生理基础。《素问·五脏生成篇》：“脾主运化水谷之精，以生养肌肉，故主肉。”脾为气血生化之源，全身的肌肉都要靠脾胃所运化的水谷精微来营养，才能使肌肉发达、丰满、健壮。如果脾虚运化功能障碍，可出现四肢困倦乏力、不耐劳作、肌肉消瘦、甚至出现四肢痿弱不用等表现。故《灵枢·经脉第十》曰：“足太阴气绝者，则脉不营肌肉”。本研究采用经典的脾胃补益方剂四君子汤等加减组成益气健脾方药治疗脾虚证大鼠模型，探讨脾虚证及益气健脾法对骨骼肌线粒体ATPase活性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 选用SPF级SD大白鼠60只(由广州中医药大学动物实验中心提供)，动物合格证号：0016901，雌雄各半，质量(200±20)g。随机分为6组：即正常对照组、脾虚模型组、四君子汤组、当归补血汤组、黄芪四君子汤组、当归补血汤合四君子汤组，每组各10只，分笼饲养，自由饮水，饲料采用标准颗粒饲料，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器 ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所提供)、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)、恒温水浴槽(上海安宁医疗器械厂)、低温台式高速离心机(中国上海TGL-16G)、紫外分光光度计(日本SHIMADZU UV mini1240)。

1.3 药物 小承气汤：大黄∶厚朴∶枳实为4∶5∶3；四君子汤：党参∶白术∶茯苓∶甘草为2∶2∶2∶1；当归补血汤：黄芪∶当归为5∶1；黄芪四君子汤：黄芪∶党参∶白术∶茯苓∶甘草为5∶2∶2∶2∶1；当归补血汤合四君子汤：黄芪∶当归∶党参∶白术∶茯苓∶甘草为5∶1∶2∶2∶2∶1。以上中药均购自广州杏园春药店，常规煎法并浓缩成20 mg/mL浓度，置4℃冰箱保存备用。

1.4 模型复制及给药 按照文献[1-2]的破气苦降加饥饱失常法复制脾虚证动物模型。各组大鼠除正常对照组外均每日灌饲小承气煎剂50 g/kg体重，隔日半量进食,自由饮水，造模15 d结束后，正常对照组与脾虚模型组给予生理盐水按10 mL/kg；四君子汤组、当归补血汤组、黄芪四君子汤组、当归补血汤合四君子汤组给药剂量分别为10.5,9.0,18.0,19.5 g/(kg·d)，各给药组剂量相当于临床用量的15倍，均连续给药4周。

1.5 骨骼肌组织线粒体的分离 实验前大鼠禁食12 h，予大鼠100 g/L水合氯酝酿腹腔注射3 mL/kg，大鼠麻醉后仰卧于手术台上，用手术剪剪开大腿的皮肤，快速取出大腿骨胳肌，称取组织块1 g在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，放入10 mL的小烧杯内，用移液管量取适量预冷的匀浆介质(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCI，0.000 1 mol/L EDTA-2NA,0.01 mol/L蔗糖，0.8%的氯化钠溶液)，用眼科小剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，制成100 g/L匀浆，再1 200 g离心10 min，取上清液，用低温超速离心机以12 000 g离心20 min弃上清，取其沉淀部分，即为线粒体，再加入匀浆介质2 mL，用超声波打碎膜性结构，制成线粒体悬浮液，在-20℃的冰箱中贮存备用。

1.6 测定原理 ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量即可判断ATP酶活性的高低。

1.7 大鼠骨骼肌线粒体ATPase活性的测定 按照ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所提供)说明书进行操作，由中山大学达晖生物技术有限公司完成检测。

1.8 统计学方法 采用统计软件SPSS 11.0软件。

2 结果

6组大鼠骨骼肌线粒体ATPase的活性(单位：每小时每毫克蛋白分解ATP产生1 umol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即1 umolpi·mgprot-1·hour-1) 见表1。

表1 各组骨骼肌线粒体ATPase活性比较 (1 umolpi·mgprot-1·hour-1)

3 讨论

脾为“气血生化之源”“后天之本”。脾主四肢肌肉的功能是由脾主运化水谷精微的功能决定的。《素问·示从容论》：“四肢懈惰，此脾精不利也。”《素问·太阴阳明论》：“脾病而四肢不用，何也?岐伯曰：……今脾病而不能为胃行其津液，四肢不得禀水谷之气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉皆无气以生，故不用焉。”近十余年来，医务工作者从实验及临床两个方面，对脾与肌肉和能量代谢的关系进行了广泛深入的研究，从“脾主肌肉”的实验研究方面，利用脾气虚证动物模型，从肌肉能量物质贮存、肌肉能量生成及肌肉能量代谢有关的环节入手，探讨脾与肌肉的关系。孙恩亭等[4-5]分别运用劳倦和饮食不节及劳倦与泻下或苦降破气中药加饥饱失常的方法所致大鼠“脾气虚”动物模型研究，发现“脾气虚”动物模型的ATP含量和能荷值、肌糖原和脂肪的含量较正常对照组明显减少，通过服用益气健脾中药后，其含量较自然恢复组明显升高，说明“脾气虚”大鼠存在着能量代谢及能源物质的不足。人体肌肉的收缩主要是由ATP的水解直接供给能量，然后肌肉储存的ATP量极少，难以维持1 min的肌肉收缩活动，而ATP的生成和利用必须在ATPase的作用才能维持动态平衡。本研究通过对骨骼肌线粒体ATPase活性的比较表明：脾虚模型组Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase的活性最低，显著低于正常对照组和四组益气健脾中药组(P<0.05)，益气健脾中药组中黄芪四君子汤组ATPase的活性最高，显著高于正常对照组和当归补血汤组(P<0.05)，其它各组与正常对照组比较无显著性差异(P<0.05)，说明脾虚证与骨骼肌线粒体ATPase的活性之间存在着正相关，黄芪与四君子汤中党参合用其补气健脾之力尤为显著，故黄芪四君子汤对脾虚证骨骼肌线粒体ATPase的活性升高的效果优于四君子汤；作为“补气生血”经典方的当归补血汤是为血虚而设，虽有黄芪补气，其实为补血，而中医治病特点是辨证论治，本实验是以脾胃气虚模型为观察对象，方不对证，故其疗效不如四君子汤理想。脾虚证时，骨骼肌线粒体ATPase的活性降低，从而使能量产生不足(ATP的直接生成减少)和能源物质(肌糖原、脂肪、蛋白质)匮乏，故临床病人和脾虚证动物出现神疲乏力，肌肉消瘦等症状，通过益气健脾中药治疗后，这些异常改变可明显得到恢复。因此，本研究验证了“脾主肌肉”“脾主四肢”的中医理论，并提示益气健脾与改善ATPase的活性及机体的能量代谢有密切的相关性。

[1]陈小野.大鼠长期造模的实验研究[J].中国中医基础医学杂志,1995,2(2):37.

[2]易崇勤,叶百宽,金敬善,等.四君子汤对脾虚大鼠胃黏膜细胞酶组织化学及血浆胃肠激素的影响[J].北京中医药大学学报,1997,20(6):31.

[3]金敬善.脾虚证动物模型的实验研究进展[J].中国中西医结合脾胃杂志,1999,7(2):65.

[4]孙恩亭,谢锦玉,李乐红,等.脾气虚大鼠骨骼肌中某些元素、酶及能荷的变化[J].中国中西医结合杂志,1993,13(1):736.

[5]杨维益,梁 峥,杨 敏,等.健脾理气法对骨骼肌能量代谢影响的研究[J].中国运动医学杂志,1994,13(1):28.