抑制性消减杂交技术（SSH）在辣椒抗病基因研究中的应用

肖仲久 李小霞 张素勤 蒋选利

（1.贵州大学农学院，贵阳，550025；2.遵义师范学院生物系）

抑制性消减杂交技术（SSH）在辣椒抗病基因研究中的应用

肖仲久1李小霞2张素勤1蒋选利1

（1.贵州大学农学院，贵阳，550025；2.遵义师范学院生物系）

基于抑制性PCR及差减杂交技术建立的抑制性消减杂交技术，因其假阳性率低、敏感性高、效率高等优点广泛应用于植物基因差异表达研究。对该技术的原理、主要优缺点及其在辣椒植物抗病性机制研究中的应用进行了综述。

抑制性消减杂交技术 植物抗病性 辣椒

众多研究表明，植物的生长、发育、衰老和死亡，组织和细胞的分化、凋亡及变异都与基因的选择性差异表达有关[1]。因此，分离并克隆差异表达基因被广泛应用于植物的改良、抗逆、抗病等研究中。目前，基因克隆主要从3个不同的水平上进行研究，即：基因组水平、转录水平和蛋白质组水平。由于真核基因组中只有15%的基因得到表达，从转录水平进行基因的寻找和分离将会简化分析背景，使目标序列相对富集，便于克隆和分析[2]。因此，从转录水平寻找和分离植物基因是最常用的方法。基于PCR技术基础上，涌现了许多分离有差别表达基因的方法，比如，mRNA差异显示技术（mRNA differential display reverse transcription PCR或DD）、代表性差异分析技术（representational difference analysis或RDA）等。但这些技术存在着诸如：假阳性率高、差异基因丰度差别大、步骤繁琐、工作量大等问题。

而抑制性消减杂交 （suppression subtractive hybridization，SSH）是基于抑制PCR和差减杂交技术建立起来的简单有效的方法[3]，因其操作简单、筛选效率高、假阳性率低等优点被广泛用于生命科学各个领域[4]。

在辣椒生产上，各产区的辣椒生产从播种到收获均受到不同程度的病害为害。主要有猝倒病、立枯病、灰霉病、白粉病、青枯病、枯萎病、病毒病、晚疫病、炭疽病、疮痂病及线虫病等[5]。因此，积极开展病害病因诊断、治疗和抗病基因功能与机制的研究是当务之急。目前，从分子水平规模筛选与辣椒病害基因的发生发展机制以及抗病基因的抗病机制密切相关的基因已成为研究热点。

故本文就SSH技术的基本原理、主要过程及该技术的优缺点等进行简要介绍，并对其在辣椒抗病基因研究中的应用进展作一综述。

1 抑制性消减杂交（SSH）技术的主要原理和基本过程

抑制性消减杂交技术（SSH）运用了杂交二级动力学原理，是一种以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。在一个循环过程中完成单链cDNA丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同cDNA序列的去除，从而富集差异表达的基因。整个过程既利用了差减杂交技术的差减富集，又利用了抑制PCR技术的高效动力学富集。

抑制性差减杂交（SSH）经过了两次差减杂交，两次抑制性PCR过程。①第一次差减杂交：将含有要分离的差异表达的组织（细胞）作为Tester，对照组织（细胞）作为Driver，分别提取2种不同细胞总RNA，并分离出 mRNA，反转录成 cDNA，分别用限制酶消化cDNA，以产生cDNA片段；将Tester cDNA分成均等的两份，分别接上接头1和接头2，然后分别与过量的Driver cDNA变性后退火杂交，第一次杂交后每个样本中有4种产物：单链的Tester cDNA，自身退火的Tester cDNA双链，Tester和Driver的异源双链，自身退火的Driver cDNA。②第二次差减杂交：合并两份杂交产物，再加上新的变性的Driver单链，再次退火杂交，并产生一种新的双链分子，它的两个5'端有两个不同的接头，使其在以后的PCR中被有效地扩增。③第一次PCR：先用DNA聚合酶将cDNA链上的接头上的粘性末端补齐，进行PCR扩增，这时只有两端分别为接头1和接头2的差别表达的序列片段才能以指数形式扩增。④第二次PCR：取第一次PCR扩增产物稀释后，进行巢式PCR，进一步扩增具有差别表达的序列。最后完成抑制性差文库的构建。

2 SSH技术在植物抗病基因研究中的应用及其主要优、缺点

2.1 SSH技术在植物抗病基因研究中的应用

早些时候，SSH技术主要集中应用在动物和人的研究上。尽管该方法在植物抗病基因上的研究起步较晚，但自1999年首次应用该方法以来，也已有多篇有关该方法在植物抗病基因研究上应用的报道[6～13]。如近2 a来，黄雪玲等以成株期抗条锈小麦品种兴资9104为材料，依照CLONTECH公司PCR-SelectTM cDNASubtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌诱导的抑制差减杂交cDNA文库。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序，对已知序列进行Blastx分析表明，所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等[14]。于秀梅等利用抑制差减杂交技术构建了条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。通过分析抗病相关基因，初步推测HR和SAR可能为小麦抗条锈病过程中的2种抗性形式。最后利用RT-PCR对4条基因进行分析，明确其在抗病过程中的表达模式[15]。张淑珍等研究利用抑制性消减杂交技术成功构建了疫霉菌诱导的大豆抗病品种绥农10差异表达的cDNA消减文库，从文库中共筛选到2 067个阳性克隆，利用BLAST在GenBank数据库中进行序列相似性比对，获得有功能的EST 375个，分析表明这些EST功能涉及大豆的抑制病原菌生长、细胞自身保护、信号传导、系统获得抗性、蛋白质合成、呼吸作用等方面[16]。吴金华等通过小麦种质N9436构建了白粉菌接种初期小麦抗性种质N9436的抑制性消减杂交文库，得到94条EST，有49条EST与已知功能蛋白同源性较高，主要涉及抗病与防御（包括生物及非生物胁迫）、能量代谢、细胞结构、蛋白质合成及加工、转运及信号转导等过程的相关蛋白[17]。

2.2 SSH技术的主要优缺点

众多的研究表明，该方法最大的优点是降低了假阳性率。其次是具有高度敏感性、速度快、效率高等优点。主要缺点首先是需要较多的原始材料，因为后续研究所需的起始mRNA量较大（一般为几微克）。消减库中的cDNA经过RsaI等限制酶消化后，不再是全长cDNA，要想获得全长序列就要用这些基因片段作为探针从cDNA文库中筛选出全长基因；但SSH技术不能同时对数个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测。此外，对植物组织而言，应尽量选择幼嫩的组织作为研究对象，RNA的分离较动物组织困难，尤其是一些老的植物组织更不易分离出高质量的mRNA。

3 SSH在辣椒抗病基因研究中的应用

较之其他植物，辣椒这方面的研究较少。仅茆振川等以含N基因的辣椒为试验材料，接种南方根结线虫 12，24，36 h的根尖材料作为测验方（Tester），相应的未接种根尖材料作为驱动方（Driver），构建了一个南方根结线虫诱导N基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库，并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选，获得了237条表达序列标签 （EST）。得到148条功能已知的EST序列，获得已知的上调抗性相关EST 68个。分离出了具有NBS-LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因，防御作用相关的类萌芽素（GLP）、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多种信号蛋白基因[18]。以辣椒双单倍体HDA149为试验材料，构建一个南方根结线虫诱导Me3基因表达早期的抑制消减杂交cDNA文库，通过高密度点阵膜杂交差异筛选，获得了309条表达序列标签（EST）。通过测序，在Gen-Bank上进行BLAST分析，30个EST片段未发现同源性基因，229个为具有同源性的已知基因，其中71个为功能未知的基因[19]。

另外，本课题组正在利用抑制性消减杂交技术进行辣椒对白粉病抗性相关基因的筛选和鉴定研究。通过对供试材料进行接菌、不接菌对照处理，利用抑制性消减杂交技术研究辣椒在白粉菌胁迫下抗性相关基因的差异表达，结合生物信息学手段确定抗性候选基因，并对其进行分离、克隆和功能性研究，进一步阐述辣椒对白粉病的抗性机制，为培育抗辣椒白粉病新品种奠定基础。

本课题组正在利用抑制性消减杂交技术进行辣椒对白粉病抗性相关基因进行筛选和鉴定，拟构建辣椒在白粉菌胁迫下抑制性消减杂交文库，研究辣椒在白粉菌胁迫下抗性相关基因的差异表达。

4 展望

辣椒因其营养丰富、味道鲜美而在世界各地广泛种植，在我国各地均有栽培，并已成为农民致富的重要经济作物之一。我国辣椒种植面积广，但由于各地环境条件相差比较大，辣椒病害种类多且为害严重，已成为我国辣椒生产的主要障碍。长期以来，主要依赖化学药剂和种植抗性品种来控制病害。但化学农药的滥用不仅加大了生产成本、给环境带来污染，同时也加速了病原菌毒力的变化。而常规育种通常所需的时间很长及新育成的品种由于病原菌的群体毒性变化而丧失抗性。因此，尝试结合功能基因组和生物信息学研究的方法和技术进行抗病相关基因的研究，深入研究植物的抗病性、病原菌的致病性以及植物与病原菌的相互关系，并探索其他可能的抗病途径，才能从根本上解决植物病害问题，同时为抗病育种研究带来新的启示[20]。SSH技术正广泛应用于该领域，SSH技术的进一步改进和提高，将有助于该技术在植物基因的分离、克隆及抗病相关基因的表达调控等方面发挥更显著的作用。

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Application of SSH to Disease-resistance Gene Expression of Pepper

XIAO Zhongjiu1,LI Xiaoxia2,ZHANG Suqin1,JIANG Xuanli1
(1.Academy of Agriculture,Guizhou University,Guizhou 550025;2.Department of Biology,Zunyi Normal College)

The suppression subtractive hybridization (SSH)based on suppression PCR and subtractive technique,with the advantage of low false positives,high sensibility,high efficiency,and so on is widely used in the differential expression of plant gene.The principle,relative merits and demerits of SSH were reviewed.The application to the research of pepper disease-resistance mechanism was summarized.

Suppression subtractive hybridization(SSH);Plant disease-resistance;Pepper

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.001

贵州省科学技术基金（黔科合J字[2009]2104号）；贵州省科学技术基金（黔科合J字（2006）2052号）；遵义市科技计划基金项目（遵市科合社字[2009]22号）；贵州大学人才科研基金：辣椒抗白粉病的分子细胞学研究

肖仲久（1980-），男，讲师，在读博士，主要从事植物免疫学及分子病理学研究，电话：13765047925。E-mail：xzj198099@163.com

蒋选利，通信作者。电话：13985471856

2008-12-24