花椰菜最适ISSR反应体系的建立及优化

陈海英 罗天宽 张小玲 唐征 刘庆

（温州科技职业学院农业与生物技术系，浙江温州，325006）

花椰菜最适ISSR反应体系的建立及优化

陈海英 罗天宽 张小玲 唐征 刘庆

（温州科技职业学院农业与生物技术系，浙江温州，325006）

以花椰菜9901A×9908杂交种为材料，用高盐低pH值法提取的基因组DNA为模板，对ISSR-PCR反应体系中的镁离子浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶量、引物用量以及最适退火温度等影响因子进行了优化和筛选，建立了适合花椰菜的ISSR反应体系：20 μL PCR反应体系，含10×PCR反应缓冲液2 μL，2.0 mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物0.2 mmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.5 U，基因组DNA约30 ng，最适退火温度为52.8℃。

花椰菜 ISSR 反应体系 优化

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）别名花菜、菜花，属于十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，属一、二年生草本植物，起源中心为地中海东部沿岸，19世纪中叶传入中国南方，是重要的蔬菜作物。花椰菜营养丰富，据日本癌症预防研究所对20种蔬菜食品的抗癌成分及抑癌试验结果分析，花椰菜含有多种吲哚衍生物，具有明显的抗癌作用[1]。花椰菜是由野生甘蓝进化而来，由于生长习性的演变和阶段性的变异，经不同环境条件和不同目标的选择和培育而形成的变种，是生物学研究的很好试材；加之其营养丰富，适应性广，在我国分布地区很广，因而也成为育种者和消费者都十分喜爱的蔬菜[2～3]。

ISSR标记是一项以SSR区域为引物结合区，以SSR间区为扩增区的分子标记技术，其多态性是来源于扩增区的DNA片段长度多态性。ISSR不象SSR具有物种特异性，其引物为随机引物，故可以像RAPD一样用于各种植物的研究。ISSR标记结合了RAPD和SSR的优点，具有模板需要量少，多态性丰富，无需试剂盒，试验成本低，操作简单，试验稳定性高等优点[4]。ISSR技术现已广泛应用于大麦、小麦、水稻、马铃薯等农作物的研究[4～6]。本研究应用ISSR分析方法，以花椰菜基因组DNA为材料，探讨ISSR-PCR反应体系中各种因素对其扩增的影响，通过单因素试验确定Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶和引物在花椰菜ISSR-PCR反应体系中的最适宜浓度，获得花椰菜ISSR反应的最佳体系，旨在为花椰菜种质资源的科学利用和分子标记辅助育种等方面提供技术支持。

表1 ISSR反应体系优化设计

图1 退火温度对花椰菜ISSR扩增的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为花椰菜9901A×9908杂交种处于旺盛营养生长期的叶片，采样后将叶片装于纸袋中，置于-70℃低温冰箱保存，用于DNA提取。

1.2 试验方法

①基因组DNA的提取和纯化 花椰菜基因组DNA的提取，采用改进的高盐低pH值法[7]。取低温保存的叶片约0.2 g，于1.5 mL离心管中，加入液氮迅速研磨成粉末，立即加入800 μL 65℃预热的高盐低pH值提取缓冲液，充分混匀，65℃保温30～60 min，不时摇晃混匀。加入300 μL的5 mol/L NaAc（pH值5.2）溶液，于-20℃放置20 min后，12 000 r/min离心10 min，上清液转至另一管中，加入0.6倍体积的异丙醇，小心混匀，静置5 min。12 000 r/min离心10 min，倾去上清液得DNA沉淀。沉淀用70%乙醇洗涤2次，风干后溶于500 μL无菌水中，再加入15 μL RNase A（2.5 mg/mL），于37℃保温30 min，加入1/5体积的3 mol/L NaAc（pH值5.2）和0.6倍体积的异丙醇，12 000 r/min离心10 min，沉淀用70%乙醇洗涤2次，风干后溶于150 μL无菌水中，-20℃冰箱保存。

②ISSR扩增反应单因素筛选 ISSR扩增反应采用20 μL反应体系，其中25 mmol/L Mg2＋1.8 μL，10mmol/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 ng/μL引物1 μL，模板约30 ng，灭菌水12.5 μL。试验初始反应程序为：94℃预变性5 min，然 后 进 入 循 环 ：94℃ 1 min，50℃ 复 性1 min，72℃延伸1.5 min，经40个循环，再经72℃延伸10 min后，于5℃保温。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中分离，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统（Electrophoresis Image Analysis System，FR-980）中拍照并保存。

图2 引物浓度对ISSR扩增的影响

③ISSR PCR中退火温度的确定和反应体系的优化 进行PCR扩增时采用梯度PCR仪（eppendorf），根据引物的Tm值在45～55℃自动设置12个温度梯度。PCR反应参考刘冲等[8]的方法进行，20 μL反应体系中，反应因素dNTP，Taq酶、Mg2＋以及引物的浓度等几个关键因子的变化进行条件优化，各参数分别设置5～7个浓度水平（表1），采用筛选的引物ISSR17（表1），进行PCR扩增条件的优化。试验中，对ISSR扩增反应某一成分设置梯度进行筛选时，保持其他成分不变，调整双蒸水用量使其总体积保持不变。

④数据处理与分析 应用复日Smart View TM生物电泳图像分析软件对凝胶图谱片段进行分析。

2 结果与分析

2.1 退火温度的确定

在进行ISSR扩增优化之前确定引物的退火温度非常重要，退火温度不仅与引物序列有关，还与物种DNA的序列有密切关系。先参照李钧敏等[9]的PCR反应条件进行引物的初筛，选择能看到清晰条带的引物ISSR17进行退火温度的确定。结果表明，退火温度对ISSR-PCR的影响非常明显：在45～49.7℃范围内，扩增条带数较少，模糊；在50.4～55℃范围内，扩增条带增多，条带清晰，亮度较大（图1）。引物ISSR17根据公式Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T）计算的退火温度为50℃，而本研究中，最适的退火温度为52.8～54.5℃，我们选择靠近Tm的52.8℃为花椰菜的最适温度。

图3 Mg2＋浓度对ISSR扩增的影响

图4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

2.2 引物浓度对ISSR扩增的影响

本研究设定了5个引物浓度梯度（图2），当加入引物量为0.4～0.6 μmol/L时，扩增的带型比较稳定一致，但从稳定性和扩增条带的强度来看浓度为0.5 μmol/L时，能扩增出比其他更清晰稳定的条带，因此把它作为最佳浓度。而当浓度增大到0.7 μmol/L时，主带减弱，条带变得模糊，背景加深（图2）。

2.3 Mg2＋浓度对ISSR扩增的影响

Mg2＋离子浓度是影响PCR结果的一个主要变化因素，它不仅影响Taq酶活性，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物结合影响引物与模板的结合效率[7]。本研究设置了7个Mg2＋浓度梯度，Mg2＋浓度对扩增的条带有明显的影响，当 Mg2＋浓度在 1.5～2.0 mmol/L时，扩增条带比较清晰、亮度较大，而且背景明显；但当浓度在2.25～3.0 mmol/L时，扩增条带呈弥散趋势，图象显得不清晰。故取2.0 mmol/L为最适浓度（图3）。

2.4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

dNTPs是PCR反应的原料，浓度过高会产生错误渗入，浓度太低导致产率太低，通常dNTPs浓度在0.02～0.20 mmol/L[10]。本试验设置了5个dNTPs浓度梯度（图4），当dNTPs为0.2 mmol/L和0.25 mmol/L时扩增条带清晰稳定，且重复性高，本研究采用dNTPs的最适浓度为0.2 mmol/L。

图5 TaqDNA聚合酶对ISSR扩增的影响

2.5 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

Taq酶的使用量也是影响PCR的一个重要因素，高浓度的Taq酶不仅成本较高，而且容易产生非特异性扩增产物，Taq酶浓度过低则会导致产物的合成效率下降[11]。本试验设置了5个Taq酶浓度梯度（图5），结果在20 μL的反应体系中，Taq酶用量为0.5 U时，扩增产物出现条带少；Taq酶用量为1.0～1.5 U时Taq酶扩增的条带清晰，且随浓度的升高，条带亮度略有增加；Taq酶用量为2.0～2.5 U时，扩增条带呈弥散趋势。因此，本研究选用1.5 U的Taq酶为最佳用量。

3 小结与讨论

随着分子生物学的应用和发展，分子标记技术（RAPD，ISSR，SSR，RFLP，AFLP，SRAP等）已成为作物品种改良的先导技术。分子标记技术具有多态性高、遗传稳定、不受环境影响等优点，已开始广泛应用于蔬菜作物品种鉴定与纯度检测中[11～12]。

ISSR是基于PCR扩增反应筛选DNA多态性的一种分子标记技术，因而影响PCR扩增反应的各种因素（如模板DNA、Taq酶、dNTP、Mg2＋以及引物等）同样影响ISSR的扩增效果[13]。因此，在研究时都应先建立起合适的反应体系并对其进行优化，以获得重复性和可靠性较高的ISSR谱带。本研究结果确定了适合花椰菜9901A×9908杂交种的最适ISSR-PCR反应体系为：20 μL反应体积，含10×PCR反应缓冲液2 μL，2.0 mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物0.2 mmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.5 U，基因组DNA约30 ng。反应程序为：94℃预变性5 min，然后进入循环：94℃ 1 min，52.8℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，经40个循环，再经72℃延伸10 min后，于5℃保温，建立了稳定的花椰菜ISSR反应体系。

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Establishment and Optimization of ISSR Reaction System in Cauliflower

CHEN Haiying,LUO Tiankuan,ZHANG Xiaoling,TANG Zheng,LIU Qing
(Department of Agriculture and Biotechnology,Wenzhou Vocational College of Science and Technology,Wenzhou 325006）

The effect of Mg2+,dNTP,primer,Taq DNA polymerase and annealing temperature on ISSR-PCR amplification reaction were studied using the genomic DNA as template,extracted with low pH,high-salt method in cauliflower.The results showed that the conditions suitable for ISSR-PCR were as follows:2 μL 10×Taq buffer,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,0.5 μmol/L primers,1.5 U Taq DNA polymerase and 30 ng template DNA in total 20 μL reaction volume,and the optimum annealing temperature was 52.8℃.

Cauliflower;ISSR;Reaction system;Optimization

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.005

浙南作物育种重点实验室资助，浙江省科技计划项目（编号2008C22094）资助

陈海英（1979-），女，博士，讲师，从事微生物及分子生物学研究。E-mail：chy2201@163.com

2008-11-21