骨髓基质干细胞临床研究进展

钦　斌　蔡建平

[摘要] 随着细胞研究的发展，骨髓基质干细胞的临床应用越来越受到重视。本文对骨髓基质干细胞的生物学特性、取材、分离、培养、临床前期研究成果和面临的问题进行了综述。

[关键词] 骨髓基质干细胞；生物学特性；取材；分离；培养；临床应用

[中图分类号] R329.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）02（a）-011－０2

1867年，Cohnheim首先提出了骨髓内含有骨髓基质干细胞（MSCs）的观点；而Frieden-stein于1966年首先发现，它是骨髓基质的组成成分，能分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。骨髓是由造血干细胞和非造血干细胞组成的器官，非造血干细胞（即MSCs）由骨前体细胞、软骨前体细胞、脂肪前体细胞、神经细胞和肌细胞前体细胞组成，因此，MSCs是由骨髓组织干细胞或前体细胞和躯体组织干细胞组成的成分及功能复杂的细胞群体[1]。许多年来，MSCs基础研究和临床应用的前期研究取得了重大进展，但是仍有许多问题尚待解决。

1细胞形态

MSCs具有3种细胞形态：①梭形细胞；②巨大扁平细胞；③体积非常小的球形细胞[2]。

2生物学特性

MSCs有以下生物学特性：①自我更新能力。MSCs在体内具有很强的自我更新能力，是传代细胞[3]。②很强的黏附性。体外培养收集细胞时MSCs容易与骨髓基质分离形成细胞悬液，体外低密度培养时MSCs迅速黏附，反复冲洗可与非黏附的造血干细胞分离[2]。③可塑性。MSCs具有可塑性，即具有多向分化的潜能。骨髓脂肪细胞株在体内可分化为真正的骨组织[4]，骨髓网状细胞在体内可转变为脂肪细胞。在适宜的微环境下，MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、星形细胞、少突树突细胞及神经细胞等，而且能跨胚层分化，属于不同胚层的MSCs或前体细胞还能分化成与本身组织不相关的其他胚层组织，如骨髓中存在成肌细胞前体细胞，神经干细胞能重新分化成造血细胞，骨髓细胞分化为神经细胞和肝细胞[5-7]。④快速增殖形成克隆的能力。MSCs能迅速产生单细胞源克隆，而且这些克隆均来源于单细胞克隆-克隆形成单位成纤维细胞（CFU-F）[5-7]。⑤可移植性。MSCs具有自我更新能力和可塑性，因此具备了可以移植的前提条件。一些临床前期研究表明MSCs移植可治疗某些疾病。

3生物学特性的改变

MSCs在体内骨髓微环境下生长并保持特有的生物学特性，但经体外适宜环境条件下培养后，许多生物学特性发生改变。①“归巢”能力丧失。大多数研究表明，原代MSCs体外培养并输注移植后，在受体中不能检测到或只能部分检测到供体的MSCs[8]。②分化潜能丧失。MSCs体外培养后，有的失去分化成脂肪细胞的能力，有的失去分化成软骨细胞和成骨细胞的能力[9，10]。③细胞形态异质性丧失。原代MSCs具有细胞形态的异质性，但经过一定时间的体外培养（传代3次），形态的异质性逐渐丧失，细胞形态主要为巨大扁平细胞[11]。④细胞融合入或核融合。当人MSCs与热休克损伤的上皮细胞共同培养时，部分细胞直接转化成上皮细胞而与其他细胞或上皮细胞融合变成双核细胞且表达上皮细胞表面抗原[12]。细胞融合入或核融合的机制和生物学意义目前尚未明确。

4细胞的采集和培养

MSCs的取材一般采用骨髓穿刺法，操作方便，创伤小，可反复取材而不影响细胞活力及机体功能。分离骨髓基质细胞的方法主要有三种：贴壁筛选法、密度梯度离心法和流式细胞分选术（flow cytometer，FCM）。贴壁筛选法经济方便但纯化程度有限，有待进一步改进。密度梯度离心法得到的细胞纯度可达95%[13]。流式细胞分选术可根据MSCs与造血细胞的表面标记的不同，用带有荧光标记的抗体从混合细胞群中获取高纯度的MSCs。BioWhittaker Inc.用表面分子CD105、CD166、CD29、CD44阳性和CD14、CD34、CD45阴性筛选法得到几乎完全纯化的MSCs[14]。

静态单层培养法是目前较为经典的细胞培养方法。这种方法简便易操作，成本低廉；缺点是培养细胞数量受培养器皿底面积限制，且不符合体内的生理环境。随着骨组织工程的研究，构建功能性组织工程骨已成为理想目标，进而对种子细胞的培养提出了更高的要求。生物反应器的使用使得MSCs的体外动态培养环境更接近于体内，从而使种子细胞功能形状等各方面更加完善。有研究表明，运用灌流式生物反应器不但可以进行多组织培养，而且还可以获得4.22×107/ml的细胞密度，长时间培养仍能保持细胞的多分化特性[15]。

MSCs体外培养需要种子数量较大，使用常规的培养方法往往需要长时间培养、多次传代才能完成。微载体培养法[16]在这一方面具有显著的优点：①兼有单层培养和悬浮培养的优点，且是均相培养；②细胞所处的培养环境均一；③培养条件（温度、pH值、CO2等）容易调节和监控；④具有较高的比表面积，培养的细胞数量更多；⑤培养操作可系统化、自动化，减少了发生污染的机会。

5临床应用

MSCs具有可塑性和可移植性，因此它与骨髓造血干细胞一样，具有重要的临床治疗价值。如何应用MSCs进行临床治疗是目前研究的热点。目前常用的应用方法有：①作为转基因靶细胞。用腺病毒把目的基因转入MSCs，然后再把它们移植到相关的受损组织或器官。②MSCs体外扩增后静脉输注移植[17]。③MSCs局部移植。MSCs局部注射到关节腔可刺激软骨细胞再生，延缓关节进行性破坏；注射到冠状动脉可使心脏缺血区心肌细胞再生；注射到脑缺血坏死灶区能诱导新的神经细胞再生。MSCs作为种子细胞具有广泛的临床治疗谱。

基础研究和临床研究表明，MSCs具有广泛的临床应用前景，但临床应用还有很多需要逾越的障碍。MSCs体外培养后细胞会衰老，增殖能力下降[18]；MSCs体外培养时会丧失部分或大部分多向分化的能力[9，10]，出现这种机制的原因不明，也没有解决办法。体外培养时MSCs丧失“归巢”能力，不能到达髓或脾脏等目的器官[19]。动物模型研究表明，输注移植骨髓前体细胞在受体体内只能获得有限的移植细胞，成肌细胞及其他细胞通过全是循环后到达肌肉组织的，细胞数量有限。目前的前期临床研究表明，虽然少量供体的MSCs能在受体体内存活，但大量证据表明MSCs不能通过全身输注来移植[20]。

MSCs的研究已经历了30多年，对它的生物学特性也有了相当的了解，许多前期临床研究展现了广泛而诱人的临床治疗前景。国内外对自体骨髓基质干细胞的基础与临床研究，主要集中于细胞体外培养扩增后再植入体内方面，但是存在着患者等待治疗时间长、所需治疗费用昂贵以及伦理学要求等诸多不足，因而严重限制了其在临床上的应用与推广。目前应用自体骨髓基质干细胞通过浓集技术（提高骨髓基质干细胞的浓度）再与骨形态生长蛋白（BMP）、自体骨及多孔生物陶瓷材料复合，然后种植于机体内使其成骨，治疗骨缺损等疾病，将会成为研究热点。

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（收稿日期：2009-01-07）