质粒DNA提取的简便方法

陈绍兴 李 沁 董 艳 杨权芬 陈 娅 钱丽芳

摘要:以质粒pBR322为对象,在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进,将酚氯仿异戊醇抽提和氯仿异戊醇抽提省去。比较了简便方法和经典方法提取质粒的效果,结果显示:两种方法均能够提取出质粒DNA,RNA的量并没有比经典方法提出来的多;简便方法抽取的质粒,蛋白含量稍稍多于后者;简便方法节省了大约一半的提取时间及大量的药品,并且减少了有害的化学物质对人体的危害,是一种经济实用的方法,完全可以满足一般实验需要。

关键词:质粒DNA;提取;方法;pBR322

中图分类号:Q78文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.002

An Improvement Method on Plasmid Extraction

CHEN Shao-xing,LI Qin,DONG Yan,YANG Quan-fen, CHEN Ya, QIAN Li-fang

(Life Science and Technology College, Honghe University, Mengzi, Yunnan 661100, China)

Abstract:Plasmid pBR322 was used in this study and some improvement wew made based on the classical extraction method.The step of extracting by phenol chloroform isoamyl alcohol and chloroform isoamyl alcohol was omitted. Comparing the result of this two extraction method, it can find that the two methods both can get plasmid DNA and the quantity of RNA was no more than it by using the classical way. After omitting the two extraction method, the amount of protein is a little more than classical method. On one hand it will save about a half time, on the other hand it also can save plenty of physic. It will decrease the harm to human. This is an economical and convenient method and it can absolutely match the need of general experiment.

Key words: plasmid DNA; extraction; method; pBR322

质粒的提取作为分子生物学领域的一项基本操作技术,几乎每天都要用到。尽管现在质粒提取的试剂盒有很多,但是对于普通的实验室,特别是科研经费不够充分的实验室,并不能实现每次都用试剂盒来提取质粒。所以,采用的还都是萨姆布鲁克[1]所提出的经典提取方法。本研究是在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进,既节省了一大半时间,还节省了耗材和药品,另外,减少了对酚和氯仿等有害化学物质的使用。

1材料和方法

1.1菌种和质粒

大肠杆菌DH5α菌株和质粒pBR322均由武汉大学谢志雄教授馈赠。

1.2质粒提取方法

先将含有质粒pBR322的大肠杆菌DH5α菌株接种到含氨苄青霉素(Amp)浓度为50 μg/mL的液体LB培养基中,37 ℃培养过夜。经典的质粒提取方法参照文献[1]进行,简便方法是在经典方法基础上,省去酚氯仿异戊醇抽提和氯仿异戊醇抽提两个步骤。

1.2酶切检测

将两种方法所提取的质粒DNA用同样的限制性内切酶EcoRⅠ进行酶切[2],取3 μL进行电泳检测,比较两种方法提取的质粒大小是否一致。

2结果与分析

2.1质粒提取

质粒提取作为实验室的一项常规操作,经常占用很多的时间,在经典方法的基础上,将酚氯仿异戊醇抽提和氯仿异戊醇抽提这两步省去,大量地节省了时间,并且质粒pBR322的提取效果也符合实验要求,如图1所示,经典方法所提的质粒DNA中含有的RNA较简便方法的方法多;再比较质粒中蛋白质含量,经典方法的上样孔无亮带,表明质粒不含蛋白质,而B的上样孔出现亮带,说明有蛋白质存在。分析原因,由于经典的质粒提取方法多出了两步有机溶解的抽提,几乎所有的蛋白质被抽提干净,而简便的方法由于省去抽提蛋白的过程,导致了最后的质粒中还含有微量的蛋白。

2.2酶切检测

将图1中的A前两管和B的前两管pBR322质粒用EcoRⅠ酶切,结果如图2所示,不管是经典方法提取的质粒还是简便方法提取的质粒,用EcoRⅠ酶切后,其大小均在4.3 kb左右,这与线性的pBR322质粒大小(4.36 kb)相符。所以,将经典方法中的两步抽提蛋白质的步骤省略,不但不影响质粒的提取,而且同样都可以被限制性内切酶所切开,可以用于分子生物学后续的酶切、连接和转化等操作。

3讨论

本研究通过对经典质粒提取方法的改进,将其中的两步蛋白质抽提操作省去,从所得的试验结果看,省去蛋白质抽提这两步后,并没有影响质粒提取的效果;此外,两种方法所提取的pBR322质粒均能够被EcoRⅠ所切开,证明两种方法所提取的质粒在本质上没有区别,都可以用于后续的酶切、连接和转化等分子生物操作。通过对两种方法的比较,很显然简便方法具备了很多的优点:其一,大大节省了质粒DNA提取的时间;其二,大大节省了大量耗材;其三,减少实验过程中有毒物质的接触。综上所述,简便的质粒提取方法具有很强的实用性。

参考文献:

[1] J 萨姆布鲁克, D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南[M].黄培堂,译.北京:科学出版社, 2005.

[2] F M 奥斯伯(美).精编分子生物学实验指南(第五版)[M].北京:科学出版社, 2008.