生物农药固态发酵综述

陈建帮 弓爱君 李红梅 邱丽娜 曹艳秋 校 逸

摘要:从生物农药固态发酵中的发酵原料、条件控制、发酵设备、毒力检测等方面对生物农药的固态发酵研究进行了综述。

关键词:固态发酵;生物农药;苏云金芽孢杆菌

中图分类号:TQ45文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.018

Review on Solid State Fermentation of Bio-pesticide

CHEN Jian-bang1,GONG Ai-jun1,LI Hong-mei2,QIU Li-na1,CAO Yan-qiu1,XIAO Yi1

(1. Beijing University of Science and Technology,Beijing 100083,China;2.China National Measuring Science Research Institute,Beijing 100013,China)

Abstract:In this paper, current developments of solid state fermentation of bio-pesticide, including raw materials, conditions control, bioreactors and toxicity assays were reviewed.

Key words:solid state fermentation;bio-pesticide;Bacillus thuringiensis

生物农药一般是指自然界中存在的生物活体,如细菌、真菌、病毒等微生物或其产生的具有防治农业病虫、草、鼠害作用的生物活性物质。在农业生产中使用生物农药替代化学农药,可以达到不污染环境、对人畜安全、防治对象不易产生抗药性、不杀伤天敌、对生态链的影响小等目的。随着生态农业和有机农产品市场的不断发展,生物农药受到了越来越多的重视,并显示出了强劲的发展势头[1,2]。

近年来,固态发酵工艺在生物农药工业生产中的应用取得了进展。固态发酵是没有或只有少量游离水存在,在具有可以满足微生物生长代谢的一定湿度的固态营养基质中进行的微生物发酵过程[3]。和传统的深层液体发酵工艺相比,固态发酵具有培养基含水量低,所需反应器体积小,产物浓度高,产品纯化费用低,无废水排放,污染物较少(属于清洁生产技术),所需通气压力低、能耗少,培养基来源广泛等优越性[4],特别适合于发展中国家生物农药的有效生产[5,6]。利用固态发酵生产的生物农药品种主要有细菌类杀虫剂,如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),真菌类杀虫剂白僵菌(Beauveria bassiana)、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)等。其中苏云金芽孢杆菌经过百年的发展已成为目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂[7]。

1生物农药固态发酵原料

固态发酵基质为微生物提供发酵所需的营养并且作为微生物细胞生长的载体。对微生物固态发酵过程中传质、传热和微生物的代谢过程产生影响[8]。固态发酵基质发酵原料的选择不仅关系到发酵水平,而且和生产成本密切相关。目前生物农药固态发酵原料主要是工农业产品加工后的副产品及其废弃物。这些原料来源广泛、丰富,可以实现这些废弃物的的资源化利用,又可以降低生物农药生产成本。

常用的发酵原料包括麦麸、米糠、黄豆粉饼、花生粉饼等。陈欣等[9]以麸皮为唯一固态发酵底物对盾壳霉的孢子生产进行了研究,通过对不同麸皮和小麦配比的底物的发酵结果进行比较,确定了利用麸皮作为唯一底物进行盾壳霉固态发酵可以达到较好的效果。陈欣等[10]还对以麸皮作为盾壳霉孢子固态发酵基质添加营养液的固态发酵进行了培养基优化。Vimala Devi等[11]利用麦麸为主要原料,添加糖蜜和酵母浸膏作为补充碳源和氮源进行苏云金芽孢杆菌的固态发酵研究,确定了一种便宜有效的苏云金芽孢杆菌生产方式。孙翠霞等[12]采用正交试验对苏云金芽孢杆菌的固态发酵培养基进行了优化,确定了固态培养基中麦麸、豆饼粉、玉米粉、酵母粉、米糠和无机盐的最佳比例。

虽然麸皮、米糠等一直作为生物农药固态发酵常用原料,但是由于他们可以作为动物饲料和人类膳食纤维素的主要来源及其高温灭菌后存在粘度增加、疏松度不够、空隙小、后续接种困难等缺点,研究人员一直致力于寻找新的固态发酵基质。

张怡等[13]尝试以废次烟草为固态发酵原料,用于苏云金芽孢杆菌的固态发酵,实现了废次烟草的综合利用,获得了质量优良的生物杀虫剂。Adams等[14]研究利用肉鸡产生的垃圾进行固态发酵生产苏云金芽孢杆菌。陶玉贵等[15]以啤酒糟为主要原料,并添加了适当的玉米粉、豆粕和无机盐进行了苏云金芽孢杆菌的固态发酵研究。杨超英等[16]用响应面分析法对以啤酒糟为主要基质的苏云金芽孢杆菌培养基进行了优化。基于食堂剩饭菜来源的广泛性及其中含有丰富的粗纤维、淀粉、粗蛋白及各种营养元素,弓爱君以食堂剩饭菜为发酵原料进行固态发酵,生产出了具有市场竞争力的苏云金芽孢杆菌生物农药。

2发酵条件控制

在固态发酵的过程中如何成功控制水活度、温度、pH值、通气与传质等影响参数是制约固态发酵技术规模化应用的重要问题[17]。

2.1水活度

水是微生物生长所必不可少的营养物质,是发酵的主要媒介。在固态发酵中,由于没有游离水存在,所以基质水活度αw必然会对微生物的生长和代谢能力产生重要影响。基质水活度αw与含水量有关。发酵基质中若含水量过大,则芽孢、晶体游离晚,发酵周期延长;含水量过低,菌体吸收不到培养基中各种营养和水分,也会使发酵受抑制[18]。在发酵过程中,基质水活度αw会随着蒸发及微生物代谢活动的进行而逐渐降低,使得发酵难以正常进行。在大规模固态发酵过程中通常使用蒸发冷却来进行温度控制,也会造成较大的水分损失,使得固态培养基需要进行水分补充[19]。通过连续通湿空气、安装增湿器或隔一段时间往底物中添加无菌水的方法可以使αw维持在微生物生长所需要的最适值[20]。

2.2温度

固态发酵基质多为有机质,导热性能差,没有自由流动的液相。随着发酵的进行,发酵底物空隙率降低,使得发酵过程中产生的代谢热难以及时扩散开来,形成温度梯度,甚至使得温度急剧上升,大大高于菌种固态发酵的适宜温度,从而影响固态发酵的发酵水平[21]。吴振强等[22]在对金龟子绿僵菌的固态发酵进行环境变量优化研究时发现温度可以对金龟子绿僵菌的菌丝生长和产孢量产生影响,当温度由适宜温度升高到接近高限生长温度时,将引起可逆性的生长率下降甚至抑制。采用热电偶传感器可以监测物料的温度和温度变化梯度[20]。在实验室规模反应器中,可以将反应器放置在温度可控的环境中(例如水浴中)进行控温[23]。在大规模固态发酵系统中,主要采用将通气、温度、湿度控制相耦合的方式作为主要的控温措施。利用干燥的无菌空气对固体培养基进行强制通风可以加快热量从固体培养基表面到气相的传递速率,带走大量的代谢热量。同时为了防止固态培养基干燥,定期对培养基喷入无菌水,以维持固体培养基的含水量[8]。

2.3pH值

pH值是固态发酵过程中的关键因素。微生物发酵有其最适合和能够耐受的pH值范围。许多固态发酵过程的pH值具有特征性的变化,只是在固态发酵过程中缺乏在线测量湿润物料pH值的有效方法,使得pH值难以控制。目前多采用的是在固态发酵时调节好培养基的初始pH值,选用具有较大缓冲能力的固态物料来进行发酵,发酵过程中通常不进行pH值的检测和控制[24]。其他措施还有在培养基中添加缓冲液,用脲取代铵盐作为主要的氮源来抵消发酵过程中生成的酸带来的负面影响。陶玉贵[25]根据固体培养基难以调节pH值的特点,利用缓冲溶液对固体培养基用水进行pH值不同程度的调整,来研究培养基初始pH值对苏云金芽孢杆菌毒力效价的影响,得到苏云金芽孢杆菌固态发酵最适pH值为7.5。

2.4通气与传质

通气有助于氧气从气相传递到固态基质表面上的微生物,同时也可以起到转移代谢热和二氧化碳的作用。通气的速率和多少取决于微生物的特性、合成产物对氧的需求程度、发酵反应产生的热量多少、底物的料层厚度、微生物产生的二氧化碳和其它易挥发代谢产物的量和底物间的有效空隙。定时完全换气或改变气体流向是控制固态发酵中气体的常用方法。通气量过大会减少基质的水分,降低基质水活度,使得固态基质需要进行水分补充。利用气相色谱分析仪器分析发酵器顶部空间的气体或用氧分析仪测定需氧量和吸收率可以对通气量进行监测,以便控制通气量。

固态发酵的传质过程包括空气进入和排出反应器的过程;无通风情况下空气自然流动引起的自然对流、扩散过程;在生物反应器壁和周围环境之间发生的传质过程;搅拌过程中的剪切效果。一般情况下,可以利用下列措施改善传质状况:以颗粒状多孔或纤维状物质作为底物,减小底物厚度,增大底物间空隙,使用多孔浅盘发酵,搅拌底物或使用转鼓反应器。目前利用较多的方法是把强制通风和搅拌相耦合起来[8]。

3固态发酵设备

固态发酵反应器的研制对固态发酵的工业化推广应用具有重要意义。通过对固态发酵传质、传热和微生物生长数学模型的研究,近年来在规模化固态发酵反应器的研制上有着显著的进展[26]。根据基质的运动情况,固态发酵反应器可以分为两类:静态固态发酵反应器,在静态体系中,整个发酵过程中固态基质保持不动,包括浅盘式生物反应器、填充床式生物反应器等;动态固态发酵反应器,体系中存在物料的混合过程,包括机械搅拌的筒、柱式反应器、流化床式生物反应器和转鼓式生物反应器等。按照固态发酵反应器规模的级别大小可以将其分为3种:实验室规模固态发酵反应器、中试固态发酵反应器和工业级固态发酵反应器。Durand[27]对各种级别的固态发酵反应器进行了详细的介绍。陈洪章等[28,29]研制出了一种工业级的气相双动态固态发酵反应器,基本思想是对固态发酵罐内的气相压力人为施以周期脉动,脉动的周期、振幅及波形将随不同发酵对象、发酵时间而改变;其次,在气相双动态固态发酵罐内设循环、风道及多组冷却排管,强制带走物料中的热量,并强制热空气与冷却盘管热量交换,降低发酵物料的温度,并保证了发酵温度与湿度的均匀一致与可调性。发酵过程中温度、湿度、pH值可控,保证纯种发酵,实现了规模化工业生产,设备投资和生产成本都远低于液体深层发酵。用苏云金芽孢杆菌进行生产固态发酵,平均毒力效价16 000 IU/mg,最高批次达23 000 IU/mg。用白僵菌进行固态发酵,效价可比浅盘培养提高2～3倍。

4生物农药毒力检测

毒力检测是对生产出来的生物农药进行质量检验的重要项目。通过毒力检测可以检验发酵结果并指导发酵过程的改进和优化。应用于生物农药毒力检测的主要方法有孢子计数法,生物测定法、高效液相色谱法、免疫分析法、质谱分析法、电泳分析法等[30]。

生物测定法进行生物农药的毒力检测是行业标准检测方法,普遍应用于实验和生产。其毒力检测方法以敏感昆虫为试虫,同时检验供试样品和标准样品对虫子的致死中浓度LC50值,并计算待测样品的毒力效价,以此来估计供试样品的毒效。方苹等[31]使用小菜蛾测定固态发酵生产出的苏云金芽孢杆菌的毒效,采用浸叶碟饲喂法检测,用纯水将试样稀释处理,然后将苞菜叶碟在药液中浸渍10 s,取出自然晾干,分别饲喂3龄幼虫,于72 h检查幼虫死活情况,计算死亡率。余子全等[32]建立了一套苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白对植物寄生线虫的生物测定方法。生物测定法可以直观的反应菌株或制剂的毒力,但是需花费大量时间饲养昆虫,而且操作程序复杂,易受被测试昆虫的虫龄、环境条件等因素影响。

倪钰萍等[33]对SDS-PAGE毒素蛋白测定、生物测定、活芽孢计数3种测定苏云金芽孢杆菌的方法进行了比较,通过对这3种方法适用范围、定性定量分析、试验周期、稳定性、可重复性、允许相对偏差等因素的考察,综合评价认为采用SDS-PAGE毒素蛋白测定更为适宜。

5结论与展望

通过对文献的分析可以看出,固态发酵在生物农药生产应用领域的研究得到了巨大发展:发酵原料来源广泛,既实现了生物农药的有效发酵,又对一些工农业废弃物实现了资源再利用;发酵条件和影响参数的控制研究逐步深入;工业化固态发酵反应器大量出现;毒力检测方法多样化。但是与液体深层发酵相比,目前固态发酵技术还缺乏全面的详细研究,距工业化大规模的最优化生产仍有很大距离。不过随着固态发酵技术优势被越来越多的人认识到,固态发酵研究必将得到更多地重视,得到更大地发展,从而推动生物农药产业的进步。

参考文献:

[1] 邱德文. 我国生物农药现状分析与发展趋势[J].植物保护,2007,33 (5):27-32.

[2] 思彬彬,杨卓. 微生物农药发展概况[J].安徽农学通报,2007,13(18):162-164.

[3] Pandey A. Solid-state fermentation[J].Biochemical Engineering Journal, 2003,13(2-3):81-84.

[4] Yang S T. Bioprocessing for value-added products from renewable resources[M]. Amsterdam: Elsevier B V, 2007: 465-489.

[5] Rodriguez D P. Redesigning the production of the Bacillus thuringiensis Bio-Pesticide within the context of subsistence agriculture in Andhra Pradesh, India[J]. Asian Biotechnology and Development Review, 2007, 9(3): 55-81.

[6] Vimala Devi P S, Rao M L N. Tailoring production technology: Bacillus thuringiensis (Bt) for localized production[J]. Tailoring Biotechnologies, 2005, 1(2): 107-120.

[7] 杨庆仙.苏云金杆菌增效细菌研究进展[J].北方园艺,2008(1): 55-58.

[8] 陈洪章,徐建. 现代固态发酵原理及应用[M].北京:化学工业出版社,2004.

[9] 陈欣,李寅,堵国成,等.以麸皮为唯一底物生产Coniothyrium minitans孢子的研究[J].应用与环境生物学报,2004,10(5): 635-638.

[10] 陈欣,李寅,堵国成,等.应用响应面方法优化Coniothyrium minitans固态发酵生产生物农药[J].工业微生物, 2004,34(1): 26-29.

[11] Vimala Devi P S, Ravinder T, Jaidev C. Cost-effective production of Bacillus thuringiensis by solid-state fermentation[J]. Journal of Invertebrate Pathology,2005,88(2): 163-168.

[12] 孙翠霞,弓爱君,姚伟芳. 苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化[J].化学与生物工程,2006,23(8): 34-36.

[13] 张怡,杨天雪,秦旌,等. 废次烟草作为载体在固态发酵体系中的综合利用[J].烟草科技,2000(7): 5-7.

[14] Adams T T, Eiteman M A, Hanel B M. Solid state fermentation of broiler litter for production of biocontrol agents[J]. Bioresource Technology, 2002, 82(1): 31-34.

[15] 陶玉贵,项驷文. 啤酒糟固态发酵生产生物农药条件的优化[J]. 安徽机电学院学报,2002,17(2): 17-19.

[16] 杨超英,陶玉贵,徐先炉,等. 响应面法优化苏云金杆菌固态发酵培养基[J].中国农学通报,2008,24(7): 69-73.

[17] 徐福建,陈洪章,李佐虎. 固态发酵工程研究进展[J].生物工程进展,2002,22(1): 44-48.

[18] 姚伟芳,弓爱君,邱丽娜,等. 苏云金芽孢杆菌固态发酵条件的优化[J].化学与生物工程,2006,23(11): 42-44.

[19] Sebastián Lekanda J, Ricardo Pérez-Correa J. Energy and water balances using kinetic modeling in a pilot-scale SSF bioreactor[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(11): 1793-1802.

[20] 李林辉. 固态培养(发酵)装置的类型、应用及问题[J]. 西华师范大学学报:自然科学版,2004,25(1): 55-60.

[21] Chen H Z , Xu F J, Li Z H. Temperature control at different bed depths in a novel solid-state fermentation system with two dynamic changes of air[J]. Biochemical Engineering Journal,2005,23(2): 117-122.

[22] 吴振强,彭景龙,李运南. 金龟子绿僵菌固态发酵环境变量优化研究[J].农药,2004,43(3): 123-126.

[23] Robinson T, Nigam P. Bioreactor design for protein enrichment of agricultural residues by solid state fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal,2003,13(2-3): 197-203.

[24] 吴其飞,黄达明,陆建明. 固态发酵新技术与反应器的研究进展[J]. 饲料工业,2003,24(8): 43-47.

[25] 陶玉贵. 生物农药固态发酵条件的研究[J].安徽师范大学学报:自然科学版,2001,24(1): 31-33.

[26] Mitchell D A, Kriegerb N, Stuartc D M, et al. New developments in solid-state fermentation Ⅱ. Rational approaches to the design, operation and scale-up of bioreactors[J]. Process Biochemistry, 2000, 35(10): 1211-1225.

[27] Durand A. Bioreactor designs for solid state fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal, 2003, 13(2-3): 113-125.

[28] Chen H Z , Xu F J, Tian Z G, et al. A novel industrial-level reactor with two dynamic changes of air for solid-state fermentation[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(2): 211-214.

[29] Chen H Z, Li Z H. Gas dual-dynamic solid state fermentation technique and spparatus:US, 7183074B2[P]. 2007-02-27.

[30] 弓爱君,孙翠霞,邱丽娜. Bt生物农药[M].北京:化学工业出版社,2006.

[31] 方苹,韦苹,范伟平,等. 苏云金杆菌固体发酵工艺研究[J]. 南京工业大学学报,2002,24(6): 84-87.

[32] 余子全,王乾兰,刘斌,等. 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选[J].农业生物技术学报,2007,15(5): 867-871.

[33] 倪钰萍,曹斌.关于苏云金杆菌不同检测方法的探讨[J]. 世界农药,2002,24(6): 25-26.