4种食源性致病菌多重PCR检测技术的研究及应用

赵 新 王 永 兰青阔 朱 珠 程 奕

摘要:为建立一种利用多重PCR技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的方法,根据沙门氏菌侵袭力蛋白A基因(invA gene)、单核细胞增生李斯特菌蛋白转录调控基因(prfA gene)、金黄色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蜡样芽孢杆菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB gene)设计引物,进行多重PCR扩增,并对多重PCR反应体系进行优化。在此基础上建立了4种致病菌的多重PCR检测体系,同时以国标法进行对比验证。结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,具有很好的应用前景。

关键词:食源性致病菌;多重PCR;检测

中图分类号:TS207.4文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.002

Study and Application on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by Multiplex PCR

ZHAO Xin, WANG Yong, LAN Qing-kuo, ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300381,China)

Abstract:In order to establish a rapid, sensitive and specific detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Salmonellla spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using multiplex PCR, according to invasion protein A gene(invA gene)of Salmonellla spp, transcriptional regulatory protein gene (prfA gene) of Listeria monocytogenes, autolysin gene (alt gene) ofStaphylococcus aureus and gyrase B subunit gene (gyrB gene) of Bacillus cereus, four pairs of specific primers were designed for multiplex PCR amplification. The multiplex PCR system and conditions of the amplification were optimized to make four kinds of food-borne pathogens have better amplification results. The results showed that the multiplex PCR method was rapid, specific and sensitive compared with national standard method. The multiplex PCR method developed in this study could provide an informative supplement to conventional microbiological methods for routine monitoring of food.

Key words:food-borne pathogenic bacteria; multiplex PCR; detection

农产品在采集、加工、运输、销售等环节容易受到微生物的污染,因此,微生物检测是农产品及其加工品卫生检测中的一项重要内容,而食源性致病菌检验是微生物检验的重中之重,关系到消费者的生命财产安全[1]。

致病菌是能够引起人类及动物发生疾病、造成生命和财产巨大损失的一群微生物(主要是细菌),其中最为典型的致病菌是沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、空场弯曲杆菌和蜡样芽胞杆菌[2,3],而包括中国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多沿用传统的细菌培养及鉴定方法,检验步骤繁琐,检验周期长,同时对于有些细菌仍无法给出正确的鉴定,不符合农产品及加工品现代检测要求[4]。

本研究旨在利用多重PCR技术建立同步检测和鉴定沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌等主要食源性致病菌的快速、简便、灵敏度高的方法,以期克服传统致病微生物检测方法的诸多缺点,得到与国标方法一致的检测结果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株的选择与培养乙型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50094、单核增生李斯特氏菌CMCC(B)54003、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63301均为本室保存。菌株复苏后接种于相应的增菌培养基中过夜培养。

1.1.2主要试剂和仪器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、Mg2+等购自Promega公司,高速冷冻离心机为Backman公司产品,凝胶电泳设备为BIO-RAD Power200及Power1000,PCR扩增仪为Thermo PX2,凝胶成像系统为SYNGENE公司产品。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成根据沙门氏菌invA靶基因、单核增生李斯特菌prfA靶基因、金黄色葡萄球菌alt基因、蜡样芽胞杆菌gyrB的基因序列,设计出扩增这4种致病菌特异性核酸片段的PCR引物,引物设计情况见表1。

1.2.2细菌DNA的提取取过夜菌液2 mL,13 200 r/min离心5 min,弃上清。沉淀中加入567 μL TE缓冲液,30 μL 10%SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K,混匀后37 ℃温育1 h。加入80 μL CTAB/NaCl和100 μL 5 moL/L NaCl,65 ℃,10 min。加入等体积氯仿异戊醇混匀,13 200 r/min离心10 min,取上清液加等体积酚/氯仿,13 200 r/min离心5 min,取上清液加0.6倍异丙醇,离心70%乙醇洗沉淀,待沉淀自然风干加50 μL去离子水溶解,备用。

1.2.3多重PCR反应条件的优化分别以4种菌的DNA为模板,对PCR反应条件优化。循环参数为94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。通过预实验发现退火温度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度对PCR结果影响较大,因此,对反应体系中这些重要参数需进行多重PCR优化实验。

1.2.4灵敏性试验将4种菌的DNA做10倍递增稀释,并采用上述PCR方法扩增,观察灵敏度。

1.2.5添加灵敏度实验取经高温灭菌的牛奶样品各6 mL,分别同时接种1,10,100 CFU/mL的4种菌悬液各1 mL,同时以不接种病原菌的牛奶作阴性对照,加入90 mL优化培养基中,30 ℃培养14 h。取2 mL增菌液提取DNA进行多重PCR检验。

1.2.6多重PCR方法和国标方法对样品检测结果的比较对30份生鲜牛乳、30份奶牛场土壤样品及22份市售散装茶叶样品同时应用多重PCR和国标方法进行检测。

2结果与分析

2.1PCR反应条件的优化

以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单核增生李斯特氏菌的DNA为模板对PCR退火温度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度进行优化。优化后的多重PCR反应条件为:10×PCR缓冲液2.5 μL,Mg2+浓度2.4 mmol/L, Taq酶浓度6 U,600 μmol/L dNTPs。引物浓度为:沙门氏菌80 nmol/L、单核增生李斯特氏菌80 nmol/L、金黄色葡萄球菌80 nmol/L、蜡样芽胞杆菌160 nmol/L。循环参数为:94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环,最后72 ℃延伸5 min,优化后电泳结果见图1。

2.2灵敏性试验

将供试菌株DNA经10倍梯度稀释后,在上述优化的多重PCR条件下,检测沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌DNA的敏感性分别为3.13,2.88,9.98,24.2 ng,见图2。

M:DL2 000;1～7:沙门氏菌DNA质量依次为313 ng,31.3 ng,3.13 ng,313 pg,31.3 pg,3.13 pg,313 fg;李斯特菌DNA质量依次为288 ng,28.8 ng,2.88 ng,288 pg,28.8 pg,2.88 pg,288 fg;金葡DNA质量依次为99.8 ng,9.98 ng,998 pg,99.8 pg,9.98 pg,998 fg,99.8 fg;蜡样DNA质量依次为242 ng,24.2 ng,2.42 ng,242 pg,24.2 pg,2.42 pg,242 fg

图2 多重PCR检测灵敏度

2.3添加灵敏度实验

应用多重PCR方法进行检测,结果见图3。从图中可以看出,多重PCR检测人为接种沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌的牛奶样品敏感性可达到0.1 CFU/mL,金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的牛奶样品敏感性可达到1 CFU/ mL,见图3。

1:空白对照;2:阴性对照;3:阳性对照;4～6:牛奶同时含沙门菌、金葡菌、李斯特菌、蜡样芽胞杆菌菌量依次为0.1,1,10 CFU/mL:M:DL2 000

图3 人为接种病原菌牛奶样品的多重PCR检测敏感性

2.4多重PCR法和国标方法对样品检测结果比较

如表2所示,在所检测的82份样品中,国标方法和本研究所建立的方法均检出41份沙门菌阳性、63份金黄色葡萄球菌阳性、12份李斯特氏菌阳性、12份蜡样芽孢杆菌阳性,结果完全一致。

3结论

多重PCR引物设计过程中不仅要考虑其特异性,而且要尽量使多对引物的退火温度一致,并且避免同对引物或多对引物之间形成引物二聚体。本试验在引物设计时使各引物的退火温度保持在53 ℃左右,4对引物之间不存在3′端配对,并尽可能地减少引物之间多个连续碱基的同源性,相对减少了引物二聚体的出现机率[5]。在多重PCR反应中,由于金黄色葡萄球菌扩增片段较大,相对不易扩增,采用降低退火温度、增加循环参数的方法,可有利于大片段引物的扩增[6]。

本研究建立的多重PCR方法将传统方法中大量的生化试验转化为一次性扩增,具有操作简便、快速、灵敏度高等特点,便于批量检测,而常规培养方法需要7 d或更长的时间,不宜大批量操作,因此,使用本方法做样品初筛,结合国家标准或行业标准可大大缩短检测周期,降低检验成本,更加适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要,更加符合农产品及加工品现代检测的要求。

参考文献:

[1] 刘家发,朱建如.食品安全存在的问题及对策[J].公共卫生与预防医学,2005,16(6):35-38.

[2] 赵志晶,刘秀梅.食品样品中大肠杆菌O157:H7复合PCR检测方法的研究[J].卫生研究,2004,33(6):716-719.

[3] Barbara M L, Tony C B, Grahame W G. The microbiological safety and quality of food[M]. Gaithersburg, Maryland, USA: Aspen publishers, 2000:374-886.

[4] 王永,赵新,兰青阔,等.四种食源性致病菌的PCR-SSCP检测技术研究[J].天津农业科学,2009,15(1):13-15.

[5] Henegariu O, Heerema N A, Diouhy S R, el al. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol[J].BioTechniques, 1997, 23:504-511.

[6] 夏颖哲,张春光,陈宜瑜,等. 福尔马林保存鱼类标本中大片段DNA的提取[J].水生生物学报,2007,31(4):485-491.