金钗石斛提取物抗白内障的体外实验研究
2009-01-25白金丽温淑湘
白金丽 温淑湘
摘要：目的：研究金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl，)总生物碱和粗多糖对白内障的抑制作用。方法：采用溶剂法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖；DMEM低糖培养基体外培养ICR大鼠晶状体，将晶状体分为7个组，分别在培养后6、12、18、24h共4个时段于解剖显微镜下观察并记录晶状体混浊度的改变；检测晶状体水溶性蛋白、谷胱甘N(GSH)的含量及总超氧化物歧化酶(T SOD)和丙二醛(MDA)的活性。结果：在培养的各个时段，正常对照组晶状体始终保持透明，各药物组晶状体混浊度与模型组相比明显较轻(P<0.05)，而金钗石斛总生物碱和粗多糖均能减轻晶状体混浊度，并能显著升高晶状体水溶性蛋白、GSH含量及T SOD活性，降低MDA的活性(均P<0.05)，其中石斛总生物碱高剂量组效果最佳。结论：金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有一定的抗白内障之效，而总生物碱的效果优于粗多糖。
关键词：金钗石斛；白内障；氧化损伤；晶状体
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1007--2349(2009)09--0057--03
白内障(cataract)是眼睛内晶状体发生混浊由透明变成不透明，阻碍光线进入眼内，从而影响了视力。初期混浊对视力影响不大，而后渐加重，明显影响视力甚至失明。在世界范围内白内障是致盲的首要病因，现在世界上大约有2千万人是由于白内障而致盲，另有1亿白内障患者需要手术恢复视力，在大多数的非洲和亚洲国家，白内障至少占盲人的一半。据我国调查的结果，白内障也是我国引起失明的最主要的眼病。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力人手，利用抗氧化剂或抗氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧化产物，阻止或逆转晶状体变浑浊，从而抑制或延缓白内障的发生发展。石斛是一种名贵中药材，抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实，石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对D半乳糖性白内障起到防治作用，石斛的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质(LPO)的产生，这些研究在一定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而，石斛化学成分复杂，其抗白内障的具体有效成分是什么，至今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体，对金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl，)的粗提物总生物碱(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白内障作用进行了探讨。
1材料和方法
1，1试验材料动物SD清洁级大鼠，雌雄不限，4～5周龄，体重(80～120)g，共计20只。由昆明医学院动物房提供，合格证号：滇实验动物证第2005035号。
药材和试剂：金钗石斛由云南鸿翔药业有限公司提供；DMEM低糖培养基(上海玉博生物科技有限公司)；胎牛血清(长春西诺生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，上海贝基生物科技有限公司)；体积分数30％过氧化氢(H2O2，浙江临安化工二厂)；吡诺克辛钠滴眼液(武汉五景药业有限责任公司，批号；070202)；Bradford蛋白质定量试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)；谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。
试剂配制改良碘化铋钾试剂：甲液：0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸，加水40mL；乙液：8.g碘化钾溶于20mL水中；将甲液与乙液等量混合后，取1mL与2mL醋酸混合，供生物碱的显色用。Molish试剂：甲液：a萘酚1g，加75％乙醇至10mL；乙液：浓硫酸；作为多糖的检测用。
仪器RⅡ型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；SHZ IliA型循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)；BSllOS型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；HI-98128型pH计(北京HANNA)SW CJ IF型超净台(苏州净化设备厂)；Galaxy s型C02培养箱(美国RS Biotech)；ST PT型解剖显微镜(日本OLYMPUS)；PRISMTMR型低温高速离心机(美国Labnet)；7200型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。
1，2试验方法1，2，1金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取方法：干燥金钗石斛切碎打成粗粉，加入95％乙醇85℃回流提取(4.5h／次×3次)，合并提取液，减压回收乙醇后得到石斛浸膏，加1mol／L HCL调节浸膏的pH为3，氯仿萃取3遍后，弃氯仿层，加浓氨水调母液pH＝11，再经氯仿萃取3遍，将氯仿层合并，减压浓缩，挥干氯仿后即得到总生物碱。将醇提后的药渣晒干后加人20倍体积的水，100℃回流提取(3h／次×4次)，合并提取液，减压浓缩后，加入95％乙醇，直至醇浓度为70％，置于冰箱内，隔夜取出沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤3遍，再经Sevag法除蛋白处理，冷冻干燥，得到粗多糖。总生物碱的检识参照文献：取少量分离所得的总生物碱于试管内，加入蒸馏水和少许二甲基亚砜(DMSO)将其充分溶解，滴在薄层板上，喷雾改良碘化铋钾试剂后，可见薄层板上在提取物溶液的点显现出非常明显的桔红色斑点，由此证明提取物为生物碱。粗多糖的检识参照文献：取多糖水溶液1mL加入Molish试剂3滴，摇匀，倾斜试管，沿试管壁缓慢滴加1mL浓硫酸，静置，可见在试液与浓硫酸交界面产生非常明显的紫色环，证明提取物为多糖。1，2，2药物配制用PBS分别将总生物碱和粗多糖配制成浓度为50mg／mL的溶液(生物碱加少许DMSO助溶)，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌处理后—20℃保存待用。1，2，3晶状体的培养及分组参照文献：颈椎脱臼处死大鼠，用眼科剪、镊迅速摘取双眼眼球，以含800U／mL青霉素、800ug／mL链霉素的冷PBS液漂洗眼球后，投入含相同浓度双抗液的PBS液中浸泡，转人超净台。约10min后将大鼠眼球转移至含500U／mL青霉素、50μg／mL链霉素的DMEM培养液中，小心从眼球后极部剪开巩膜，取出晶状体，去除晶状体表面的虹膜和玻璃体，晶状体经PBS液漂洗2遍后，再用DMEM液漂洗1遍，然后再放入已预热的24孔组织培养板中培养，每孔含1mL DMEM培养基(含20％胎牛血清、100μ／mL青霉素、100μg／mL链霉素)，预培养5h(37.0℃、体积分数5％COD后，剔除受损伤或已混浊的晶状体。将35只未受损伤、透明的晶状体按照随机原则分7个组培养，每组5只。正常对照组(DMEM培养基+10％胎牛血清)，模型组(正常组培养基+2mmol／L H2O2)，生物碱高、低剂量组(正常组培
养基中各加入2mmol／L的H2O2，同时分别添加4、2mg／mL生物碱)，多糖高、低剂量组(在正常组培养基中各加入2mmol／L的H202，同时分别添加4、2mg／mL粗多糖)，阳性对照组(正常组培养基+2mmoL／L的H20z+10％吡诺克辛钠滴眼液)。上述各组培养基均含IOOU／mL青霉素及100μg／mL链霉素。1，2，4观察并照相记录晶状体混浊度加药培养后，每6h更换1次培养液以保持H2O2浓度不变。同时观察并记录各组晶状体混浊度。离体培养晶状体混浊度的分级方法参照文献。1，2，5晶状体水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性检测晶状体拍照后，用冷PBS液洗涤2遍，尽量洗净培养液，再用滤纸吸干水分，称质量。按质量与体积比为1:10的量加入冷PBS液，在冰浴上充分匀浆后倒入2mL离心管中，4℃、12000r／min离心20min，取上清即为晶状体水溶性蛋白，采用Bradford法检测定蛋白含量。取剩余上清，分别采用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶(T SOD)活性，采用硫代巴比妥酸(thibabitu-ric acid，TBA)法检测MDA活性，以上操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。1，2，6统计学方法应用统计软件SPSS11.5对所有数据进行统计分析。
2结果
2，1各组药物对晶状体混浊度的影响各时段晶状体混浊度经量化处理后，进行t检验，各个药物添加组中，阳性对照组、生物碱高剂量组晶状体混浊度较模型组显著减轻(均P<0.05)；生物碱高、低剂量组及粗多糖高、低剂量组晶状体混浊度与阳性对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。将各组晶状体混浊度与过氧化氢损伤的时间进行相关性分析，其中生物碱高剂量组差异有显著性意义(P<0.01)，其他各组差异也均有显著性意义(P<0.05)，由此可见，随H2O2作用时间的延长，晶状体混浊度逐渐加重。结果见表1。
2，2各组药物对晶状体水溶性蛋白、GSH含量及MDA、T—sOD活性的影响由表2可见，模型组与正常对照组比较，水溶性蛋白含量、GSH含量、T—SOD活性均显著降低，MDA活性显著升高(均P<0.05)，而阳性对照组、生物碱组、粗多糖组可显著升高水溶性蛋白、GSH含量以及T—SOD活性，降低MDA活性，各给药组与模型组比较，差异均有显著性意义(P<0.05)。生物碱高剂量组水溶性蛋白含量显著高于阳性对照组(P<0.05)，GSH含量除多糖低剂量组显著低于阳性对照组外(P<0.05)，其他各实验组与阳性对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；T—SOD活性除生物碱低剂量组和多糖低剂量组显著低于阳性对照组外(P<0.05)，其他各组与阳性对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；MDA活性除生物碱高剂量组显著低于阳性对照组(P<0.05)外，其他各组与阳性对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。
3讨论
晶状体的氧化损伤是目前常用的白内障研究模型，而H2O2是很好的氧化损伤诱导剂。体内抗氧化系统功能下降或氧化作用增强均可导致眼组织的损伤，诱发或促进白内障的形成。而活性氧簇，如H2O2、超氧阴离子、单态氧、氢氧根等可以引起很多生物学变化，最终使晶状体的水不溶性蛋白增加而形成白内障。GSH是一种抗氧化酶，在晶状体中含量较高，对晶状体起着多方面的重要作用。SOD和MDA常常相互配合用以反映组织细胞氧化／抗氧化系统功能的平衡。本研究采用体外构建氧化损伤白内障模型的方法，对金钗石斛总生物碱和粗多糖的抗白内障作用进行探讨。结果显示，模型组可溶性蛋白含量显著低于正常对照组，而各用药组可显著缓解可溶性蛋白的减少，生物碱高剂量组尤其明显；同时，金钗石斛的提取物总生物碱和粗多糖均可提高晶状体GSH含量及SOD活性，同时降低MDA活性，即通过提高晶状体抗氧化能力而达到抑制白内障的作用。
金钗石斛能显著提高SOD水平，降低LPO而起到抗白内障的作用，但其抗白内障的确切有效成分至今仍未见报道。本实验证实，金钗石斛的两种药效部位(总生物碱和粗多糖)在体外可通过减轻晶状体的氧化损伤而抑制白内障的进程，且总生物碱的效果优于粗多糖。然而，金钗石斛化学成分复杂，据文献报道，其总生物碱含量达0.4％～0.6％，种类有30多种，多糖含量也高达4％，并以各种不同的形式存在，因此，下一步研究可从这两种粗提物人手，进一步挖掘金钗石斛抗白内障的确切有效成分，并阐明其抗氧化的具体反应过程，这对于抗白内障的药物研究以及金钗石斛药用价值的开发都有着重要的意义。
