多粘芽孢杆菌ＪＷ—７２５抗菌活性物质及其发酵条件的初步研究

赵德立　曾林子　李　晖　陈金瑞　刘成君

摘要多粘芽孢杆菌Jw—725对柑橘青霉具有很强的拮抗作用。通过5因素4水平正交试验明确，应用LB培养基培养，初始pH 9．o，30℃．通气量loomL接种量为10％．140 r／min振荡培养?2h时的发酵液具有最佳抗苗活性。该菌胞外抗菌物质可用乙酸乙酯单一溶剂提取。

关键词生物工程；多粘芽孢杆菌；抗真菌活性物质；发酵条件

中图分类号S 482．212

芽孢杆菌具有抗菌防病作用和很强的抗逆能力，其中许多性状优良的拮抗菌株已成功地应用于植物病害防治。芽孢杆菌抗菌防病机制包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性，其中拮抗作用是其最主要的抗菌机制。芽孢杆菌产生的抗菌物质主要有几丁质酶和葡聚糖酶等蛋白、抗菌肽以及一些次生代谢产物。

柑橘青霉菌是柑橘贮藏期和运输期中的重要病原真菌，通常用甲基托布津、多菌灵等化学药剂防治。研究柑橘病原真菌的拮抗菌，为解决病原菌对化学农药的抗药性和果品农药残留问题，寻找新的途径。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1拮抗菌

多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymy,ra jW—725)由本实验室从西藏类乌齐协马高山口草甸(海拔4671m)土样筛选得到。

1．1，2病原指示菌

柑橘青霉菌(Penicillicum italicum)为本实验室分离保存。

1．1．3培养基

(1)LB培养基：酵母膏5．0 g，蛋白胨10．Og，NaCl 10．0g蒸馏水1000 mL，pH 6．0—9．0．121℃灭菌20min。

(2)PDA培养基：20％马铃薯汁100ML葡萄糖2.0g，琼脂2.0g，pH 6．0～7．O，115℃灭菌30min。

(3)NA，BPY，YPG培养基.

1．2方法

1．2．1同步培养抑菌试验

在PDA平板上接指示菌柑橘青霉菌孢子和多粘芽孢杆菌JW 725各1环。两点相距5 cm，27亡恒温培养粕正放培养3d，观察结果。

1．2．2多粘芽孢杆菌液体培养

种子培养：接种B．pol3wO,．roJW 725单菌落到20 n、I。液体LB(100ML三角瓶)，30℃，140 r／min，振荡培养48h发酵培养：10％接种量，接种子培养液到100血。液体I卫培养基中(500mI三角瓶)。30℃，140r／min，振荡培养72h。

1．2．3抑菌活性的检测

抑菌圈测量采用牛津环法和打孔法。

1．2．4蛋白浓度的测定应用考马斯亮蓝法。

1．2．5抑菌作用观察

肉眼观察p．italicum的菌落正常菌丝和受拮抗菌抑制后的形态、颜色变化；分别挑取正常户．italicum幼龄菌丝、产孢菌丝及受拮抗菌抑制的菌丝制片，石炭酸美兰染色，100倍油镜观察具微观形态变化。

1．2．6正交法确定多粘芽孢杆菌最佳发酵条件…

考察5个因素：培养基种类、初始pH、培养时间、通气量及接种量对多粘芽孢杆菌JW 725产生拮抗物质的影响，并通过比较得到5因素的最佳配比。

按正交表5因素4水平安排试验，取不同培养条件下的发酵液，分别测菌液吸光值(()Doso)，无菌发酵液的粗蛋白吸光值(OD)和发酵液的抑菌活性(抑菌圈直径)。

1．2．7拮抗菌生长曲线与抑菌时程曲线

于不同时刻，分别取多粘芽孢杆菌JW－725LB发酵培养液，测定菌悬液吸光值(OD₅₈₀)和测量抑菌圈直径大小。

1．2．8发酵液中抗菌活性物质的定位

(1)胞内发酵液离心得菌体，经超声波破壁和石英砂研磨破壁，以磷酸盐缓冲液(PBS)为破壁缓冲液，离心并作无菌过滤，得无菌破碎液，做抑菌试验，测量抑菌圈。

(2)胞外用真空旋转蒸发仪浓缩无菌滤液，浓缩100倍，做抑菌试验，测量抑菌圈。

(3)孢子平板上放置一张无菌滤膜，上面点多粘芽孢杆菌jW—725单菌落，正放，培养2～3 d，揭滤膜，观察抑菌情况。

1．2．9抗菌活性物质的提取

(1)饱和硫酸铵沉淀

发酵液用饱和度日80％硫酸铵沉淀，PBS缓冲液稀释，经o．22um径无菌滤膜过滤得无菌蛋白滤液，4℃冰箱保存。用粗蛋白液做抑菌实验，无菌LB液体培养基做对照。

(2)乙酸乙酯抽提和浓缩

发酵液离心上清，加等体积乙酸乙酯于分液漏斗中振荡混匀过夜，收集乙酸乙酯层并转入球形漏斗，真空旋转蒸发浓缩，用少量无菌水洗出。用该浓缩液做抑菌实验，无菌水做对照。

2结果

2．1同步培养抑菌试验

多粘芽孢杆菌JW～725在PDA平板上对柑橘青霉有较强抑菌力，如图1。同步对峙培养3 d后，病原菌柑橘青霉长势较快，漫布大部分平皿；拮抗菌多粘芽孢杆菌的菌落直径约1 Chl，其与病原真菌接触方向，有明显透明弧形抑菌带，带宽1．o一1．5cm。

2．2多粘芽孢杆菌发酵液对柑橘青霉菌的影响

在PDA含柑橘青霉菌孢子平板上打孔，加多粘芽抱杆菌发酵液，培养3d后，平板上出现抑菌圈“双圈”现象，内圈有柑橘青霉菌增生堆积；外圈柑橘青霉菌菌丝由幼龄白色变为成熟的青绿色，并从抑苗圃边沿开始，由内向外变为枯黄色，而正常菌丝则保持青绿色至长满孢子。

显微镜下油镜观察，抑菌圈周围被抑制的柑橘青霉菌菌丝有大量异常分支，分支菌丝较短，但未见菌丝有明显破裂现象。

2．3最佳发酵条件正交试验结果及分析

分别对多粘芽孢杆卤JW-725菌株浓度，蛋白质含量，发酵液抑菌圈直径的正交试验结果按文献L11)进行直观分析。由表2可知，发酵条件5因素对多粘芽孢杆菌JW—725菌体浓度的影响，大小顺序为：通气量>培养时间>培养基>接种量>培养基初始pH。对发酵液蛋白含量的影响，大小顺序为：培养基>接种量>培养基初始pH>培养时间>通气量。

发酵条件5种因素对多粘芽孢杆菌JW—725发酵液活性的影响大小顺序为：培养基>接种量>培养基初始pH>培养时间>通气量。

试验也发现5种因素4水平的多粘芽孢杆菌JW 725最佳抑菌活性的发酵条件为：LB培养基，初始pH9，通气量100 mi接种量Io％，发酵时间72h。

2．4多粘芽孢菌杆生长曲线和抑菌时程曲线

如图2所示，多粘芽孢菌杆JW—725在培养18h时达到菌体最大浓度，从菌体开始生长到稳定期，发酵液中都有抑菌活性，12h有最大抑菌活性。图2多粘芽孢杆菌Jw—725发酵液OD值与抑菌活性曲线

2．5抗菌活性物质的定位

经过多种方法破碎多粘芽孢杆菌JW-725细胞，无菌细胞破碎液均没发现有明显抑菌圈。发酵上清液，经o．22um孔径滤膜过滤，也未发现有明显抑菌圈。将无菌滤液经真空旋转蒸发浓缩100倍后，有明显抑菌圈出现。

直接在无菌滤膜上点拮抗菌平板培养发现，膜上拮抗菌菌落直径5 mm，膜下产生直径13 mm抑菌圈。表明多粘芽孢杆菌JW-725产生抗菌物质，泫活性物质能够透过o．22um孔径滤膜。

2．6抗菌活性物的提取

1)发酸液经过80％硫酸铵沉淀，蛋白粗提液未经过滤膜过滤的有明显抑菌活性；但经滤膜过滤后未表现有明显抑菌活性。

2)发酵液经乙酸乙酯抽提浓缩，无菌水稀释做抑菌实验，有明显抑菌活性。

在I．B固体平板上涂布少量乙酸乙酯抽提浓缩液，未发现有多粘芽孢杆菌长出，排除可能残留菌体的影响，表明乙酸乙酯可把发酵液中抑菌物质初步抽提山来。

3讨论

不同测量方法时发酵液抑菌活性测定有不问结果。相同发酵液样品，用打孔法的抑菌圈比牛津环法的抑菌效果明显，抑菌圈大，且有双圈现象。柑橘青霉菌菌丝受多粘芽孢杆菌和拮抗物质共同影响．颜色发生异常变化。这种异常变化能在正常菌丝产生扩散，引起扩散的原因是否是因为拮抗物质在菌丝中的扩散还是柑橘青霉菌的某种信号传导，有待确定；汕镜下观察发现，柑橘青霉菌堆积的菌丝有大量异常分支，但未发现有菌丝破裂现象。

多粘芽孢杆菌体生长及其活性物质的积累：多粘芽孢杆菌培养18h后进入菌体生长稳定期，在菌体发酵后期，发酵液中抑菌活性略有增强。

拮抗物质与菌体的协同作用对抑菌活性的影响：发酵原液有明显抑菌效果，发酵上清液(有残留多粘芽孢杆菌)培养2d后，孔内或圈内明显有菌体生长，也有较强抑菌活性，其无菌滤液培养2d后无明显抑菌效果，而滤液浓缩后有抑菌效果。发酵液离心上清经过乙酸乙酯抽提，可抽提到拮抗物质。这表明，多粘芽孢杆JW-725菌株产生拮抗物质的产量偏低，发酵液的抑菌活性是受到菌体本身和活性物质的双重影响，并且多粘芽孢杆菌菌体本身对柑橘青霉菌的影响可能比较大。