4′-N,N-二乙氨基-3-羟基苯并黄酮激发态分子内质子转移机制的溶剂极性效应

关键词：4′-N，N-二乙氨基-3-羟基苯并黄酮；激发态分子内质子转移；密度泛函理论/含时密度泛函理论；溶剂极性效应；荧光动力学

1 引言

激发态分子内质子转移（ESIPT）是一种在化学和生物体系中重要的基础光化学反应，它主要发生在具有分子内氢键的发色团中。ESIPT可以用如示意Scheme 1所示的四能级模型描述：当分子被光激发后，通过Frank-Condon跃迁迅速生成分子构型不变的“Normal”激发态（N*态），N*态随后会通过激发态分子内质子转移（ESIPT）过程转化为N*态的“Tautomer”激发态（T*态）。通常情况下，N*和T*态可以通过双荧光发射的方式回到各自基态，而处于Tautomer基态（T态）的分子又可以通过基态分子内质子转移（GSIPT）反应回到Normal基态（N态） 1，最终完成四能级循环。

在具有ESIPT特性的分子中，3-羟基黄酮衍生物（3-HFs）因其来自天然，且具有对周围环境（主要是各种溶剂）变化敏感的荧光性质而引起人们广泛关注2，3。对3-HFs荧光特性的溶剂效应研究已被应用于各种领域，如：激光材料4、监测生物柴油中甲醇含量的比率型荧光探针5、监测脂滴形貌的动态荧光成像探针6等。

自20世纪90年代以来，对3-HFs的ESIPT机制的溶剂效应研究已广泛开展7–9。在非质子乙腈/苯混合溶剂中，研究者开展了对4′-N，N-二烷基氨基-3-羟基黄酮的ESIPT动力学的实验和理论研究10。Chou等人报道了从正庚烷转变为甲醇时，4′-N，N-二乙氨基-3-HF的N*态发射峰强度显著增加且大幅红移（gt; 3000 cm−1） 11，他们提出：在强极性、质子型溶剂乙醇中，4′-二乙氨基向羰基氧原子发生了分子内电荷转移，从而导致N*态具有两性离子构型。Shynkar等人研究揭示了4′-N，N-二乙氨基-3-HF的ESIPT反应（在两个激发态之间的快速可逆反应）在几十皮秒的尺度上发生12。Roshal等人探索了溶剂效应对4′-二甲基氨基-3-HF中ESIPT速率的影响，该分子可以在超快时间尺度上形成分子内电荷转移（ICT）态13。Douhal等人则在同一个化合物的研究中观察到其ICT与质子转移的竞争关系14：非极性溶剂中，ICT不会发生，只在2 ps时间内发生质子转移过程；极性溶剂中，ICT发生在100–200fs内，而质子转移则在几皮秒到几十皮秒内发生。此外，Chou等人使用飞秒荧光上转换技术并结合从头算，提出：不同溶剂导致4′-N，N-二乙氨基-3-HF的电子态势垒不同，从而使其N*和T*态之间存在很大平衡极化差异，最终影响正向和反向ESIPT速率15。Rumble等人使用飞秒时间分辨克尔门发射光谱技术研究4′-N，N-二乙氨基-3-HF在碳酸丙烯酯/乙腈混合溶剂中的ESIPT动力学，也得到类似结论16。Ghosh等人研究发现，在氢键溶剂中，由于4′-N，N-二甲基氨基-3-HF与溶剂会形成分子间氢键，从而导致激发态分子较慢的溶剂弛豫过程，测得～100 ps的ESIPT时间常数17。另一项研究表明，该化合物在三种不同烷基链长的正-烷基醇中也存在非常慢的ESIPT过程，并且ESIPT和N*溶剂化时间常数均随着烷基链长单调增加18。Kuang等人使用‘pump-dump-probe’光谱技术，揭示了4′-N，N-二乙氨基-3-HF存在超快的基态分子内质子转移（GSIPT）动力学过程，同时证明该过程是一个溶剂依赖的不可逆过程1。Chen等人使用DFT和TDDFT方法对4′-甲氧基-3-HF 3和4′-二甲基氨基-6，7-二甲氧基-3-HF 19的ESIPT溶剂效应进行了理论研究，发现随着溶剂极性增加，ESIPT逐渐变得困难，这与早期实验结果相一致。

已有研究表明苯并-3羟基黄酮（苯并-3HF）衍生物是一类在生物体系中具有潜在应用价值的一氧化碳释放分子（CORM） 20，21。4′-N，N-二乙氨基-3-羟基黄酮（D-HBF）则被最近的研究确认是一种高效的脂滴成像荧光探针6，因其具有与3-HF相似的ESIPT溶剂效应。此外，由于该衍生物在结构上具有扩展的π电子云体系，从而使其光谱响应范围变大。然而，关于D-HBF详细的ESIPT溶剂调节机制研究尚未见诸报道。

本研究采用多种光谱技术并结合理论计算，系统探讨了溶剂极性对D-HBF的ESIPT的调控机制。首先选择了三种极性依次增大、极化率基本相似的非质子型有机溶剂，分别为：环己烷（CYH）、乙醚（DEE）和四氢呋喃（THF）。实验和理论研究均表明溶剂极性会影响D-HBF的ESIPT反应平衡。4′-N，N-二乙氨基的引入导致N*态具有ICT特性，从而增强了其ESIPT动力学对溶剂极性的敏感性。溶剂极性增加会导致D-HBF正向和反向ESIPT反应能垒变大，从而导致相应的质子转移速率降低。此外，溶剂极性增加会降低N* T*吉布斯自由能变化的绝对值，最终导致平衡向N*态移动。本研究从实验和理论上系统地研究了溶剂极性对苯并黄酮衍生物的ESIPT机制影响，为其作为荧光探针的开发奠定了理论基础。

2 实验与理论计算

2.1 试剂

4-二乙氨基苯甲醛（98%）购于北京伊诺凯科技有限公司（中国北京），1-（3-羟基萘-2-基）乙酮（95%）来自药明康德（中国上海）。其他所有试剂和溶剂（gt; 99%）均来自北京通广精细化工公司（中国北京）。所有试剂均未经纯化，直接使用。

D-HBF 的合成和结构表征参考SupportingInformation 6。

2.2 实验方法

1H NMR使用Bruker AM 600 MHz谱仪（德国，卡尔斯鲁厄，布鲁克公司）测试。紫外-可见吸收光谱采用Carry 60 UV-Vis （美国，加利福尼亚州，安捷伦公司）分光光度计测试，荧光光谱使用FS5荧光光谱仪测量（英国，爱丁堡，爱丁堡仪器公司）。荧光发射光谱的激发波长（λex）为430 nm，测量时将λex处吸光度调至lt; 0.1。绝对荧光量子产率（ΦFL）使用FLS 980荧光光谱仪（英国，爱丁堡，爱丁堡仪器公司）测得（积分球）。D-HBF在三种溶剂中的荧光寿命（τ，0–50 ns范围）使用FLS980-STM荧光光谱仪（英国，爱丁堡，爱丁堡仪器公司）的时间相关单光子计数（TCSPC）模块结合爱丁堡仪器公司的EPL-405 ps脉冲二极管激光器作为激发光源测得。其中，待测样品的在420 nm处吸光度为0.02。仪器响应函数（IRF）用30%的硅胶-水悬浊液作为散射体，采用与样品相同的测试方法测得（120ps）。

D-HBF在0–600 ps时间尺度的荧光寿命（τ）使用条纹相机测定。通过钛蓝宝石放大器（Mira-900Coherent，美国）获得工作频率为76 MHz且脉冲持续时间约为100 fs的830 nm脉冲激光。该激光被分成两束光：一束用于触发条纹相机；另一束先经过BBO晶体倍频到415 nm，再通过脉冲选择器将其降低到3.8 MHz，用来激发样品。样品发出的荧光由条纹相机（C5680，滨松，日本）收集。其中，条纹相机IRF ～10 ps。

2.3 计算部分

所有理论计算均使用Gaussian 16程序22，采用密度泛函理论（DFT）和时间依赖的密度泛函理论（TD-DFT）方法，结合B3LYP-D3/6-311+g（d，p）基组进行计算。为更准确地计算弱静电力相互作用，使用DFT-D3进行色散校正。此外，采用自洽反应场（SCRF）中的极化连续介质模型（PCM）对相应的溶剂环境进行模拟。在构象优化过程中，分子的键长、键角或二面角没有施加任何限制。分别计算了D-HBF的N、N*、T和T*态红外振动频率和偶极矩，计算结果没有虚频存在，表明优化的结构代表能量最小值。为了研究ESIPT反应与氢键之间的关系，计算了D-HBF在S0和S1态下势能曲线，O―H键长以0.05 Å （1 Å = 0.1 nm）每步的增量变化了26步。

吉布斯自由能的值是根据数学公式G = E +ΔGcorr + ZPE进行矫正，其中ΔGcorr吉布斯自由能校正项，ZPE是零点能项22。

3 结果与讨论

3.1 UV-Vis吸收光谱和荧光光谱

图1给出了室温下D-HBF在三种溶剂中的稳态吸收和发射光谱（结果归一化）。相应的光谱信息在总结于表1中。三种溶剂分别为：环己烷（CYH）、乙醚（DEE）和四氢呋喃（THF）；它们具有相似的极化率，但极性有显著差异，Table S1中分别用溶剂的极化因子R（η）和极性因子P（ε）表示它们的差异，该表中另一个溶剂极性参数Δf 23，是基于溶剂的介电常数（ε）和折射率（η）计算得出。

三种溶剂中，D-HBF在350–470 nm范围内都呈现典型的π–π*跃迁吸收峰。其中，在CYH中的吸收光谱表现出清晰的振动结构，而在DEE和THF中，由于溶剂的极性效应导致精细结构消失。随着溶剂极性的增加，吸收峰逐渐展宽和红移。在所有溶剂中都观察到D-HBF的双荧光发射峰。450–600nm和600–750 nm范围内的发射带可分别归属为N*和T*发射（如示意图1所示）。随着溶剂极性的增加，N*和T*发射带均发生红移，其中N*发射比T*发射红移更为显著。有趣的是，溶剂极性的增加导致N*的斯托克斯位移相比于T*显著增加（见表1），表明N*能级对溶剂极性变化更加敏感。T*在三种溶剂中斯托克斯位移（约7000 cm−1）都异常大，结合双荧光发射现象，表明D-HBF发生了ESIPT反应16。

图S1展示了N*和T*态斯托克斯位移与溶剂极性因子P（ε）和Δf之间的相关性。N*发射的斯托克斯位移与两种溶剂极性因子都显示良好的线性关系。线性拟合的斜率表明，溶剂极性对N*的斯托克斯位移有显著影响，而对T*的斯托克斯位移影响则不明显。其中，N*和T*态的相对发射强度比（IN*/IT*）随着溶剂极性的增加而逐渐变大，表明DHBF发生的ESIPT反应对溶剂的极性具有一定的依赖关系。

3.2 荧光动力学研究

图2给出D-HBF在不同溶剂中测得的、在N*和T*特征发射波长下的荧光动力学衰减曲线（采用TCSPC技术），内插图显示了条纹相机测量得的lt;600 ps的荧光动力学。在405 nm激发下，N*态在仪器响应函数时间内生成，呈现二指数过程衰减：发生在数百皮秒内的快过程和发生在几个纳秒内的慢过程。N*的快速衰减伴随着T*快生成，表明两者之间存在动力学相关性（图2内插图所示）。当T*的生成达到最大值后，又在15 ns内衰减完全，相应的动力学分析结果总结于表2中。

动力学拟合结果表明：溶剂极性增加导致N*快衰减过程（～数百皮秒内）时间常数变长而相对占比减少，该过程对应于N*通过ESIPT转移到T*的时间常数；N*态的慢衰减过程时间常数与T*态的衰减时间常数相似（范围在2.27–3.47 ns），且随溶剂极性增加而减小。T*和N*衰减时间常数的相同表明它们之间存在快速ESIPT动态平衡9。

根据示意图1中所示的反应模型，可使用公式（1）和（2）来计算ESIPT的正向（kpt）和反向（k−pt）质子转移（PT）速率24，25。其中，A1和A2分别代表N*态的快速和慢速衰减物种的占比，τ1是表2中N*快速衰减物种寿命。最后，计算得到的速率常数以倒数的形式展示在表3中。

结果表明：随着溶剂极性增加，kpt和k−pt都减少，但kpt的变化比k−pt更明显。所以，ESIPT平衡常数Keq随溶剂极性增加而降低，表明ESIPT平衡向N*态移动16。

3.3.1 几何结构信息（氢键参数：长度、角度和O―H伸缩模式的IR振动频率）

4-羰基与3-羟基之间的分子内氢键强度是ESIPT发生的结构基础。本文分别计算了3-羟基的键长、键角以及红外（IR）振动频率进行验证2。使用DFT 和TD-DFT 理论结合的B3LYP-D3/6-311+g（d，p）方法，分别对D-HBF在三种溶剂中处于N、N*、T和T*态的构象进行优化，优化过程中没有对键长、键角或二面角施加任何限制。同时，获得了D-HBF在N、N*、T和T*态的振动频率且没有虚频，证实优化结构都处于局部能量极小点。

D-HBF在光激发过程中，3-OH键长（dO―H）从N态跃迁到N*态时变长而氢键距离（dHB）缩短（如表4所示）。以上结果表明，在N*态下氢键的强度增长，比N态更易发生质子转移，所以在这些溶剂中N*态存在ESIPT反应。此外，N*态下的O―HꞏꞏꞏO键角（δO―HꞏꞏꞏO）比N态更接近180°，进一步证实N*态下氢键增强。而且，从N态到N*态的转变过程中3-OH伸缩振动模式的红外振动频率向低频移动，也支持了上述观点。在计算结果中可以看到溶剂极性对分子内氢键的影响显而易见。随着溶剂极性的增加，N态下的氢键长度（dHB）从2.01827 Å增加到2.02724 Å，而在N*态下从1.87741 Å增加到1.89952Å。尽管两种态下的键长都随着溶剂极性的增加而逐渐变长，但N*态下的变化更为显著。同样，3-OH伸缩模式的红外振动频率随着溶剂极性的增加向高频移动，在N*态下频率的变化更为明显。其中，N态，从3598 cm−1增加到3606 cm−1，N*态从3372cm−1增加到3404 cm−1。

总结来说，N*态相对于N态对溶剂极性变化更为敏感。当溶剂极性增加时，激发态下的分子内氢键减弱。所以，ESIPT过程逐渐变困难。T*的溶剂极性依赖性方面与N相似，而T则与N*相似。以上结构变化最终反应在热力学上的变化，影响到系统内部的动态变化。

3.3.2 前线分子轨道分析

图3展示了D-HBF在CYH、DEE和THF中的前线分子轨道（FMOs）的电子密度图，包括最高占据分子轨道（HOMO，对应于N）和最低未占据分子轨道（LUMO，对应于N*）。通过对比讨论分子骨架上的电子分布以及电子转移行为。D-HBF的T和T*对应的FMOs作为参考，在Supporting Information中以图S2展示。光激发后，HOMO中的电子到跃迁到LUMO，导致电子分布不平衡进行重组。根据图3中所示的电子密度分布发现D-HBF从HOMO到LUMO的跃迁呈现π–π*特征。为了详细讨论和分析电子分布和电子转移行为，分子骨架被划分为两个部分（Part1和Part2），使用Hirshfeld方法26计算了两部分的电子密度百分比。D-HBF在三种溶剂中从HOMO到LUMO的跃迁时，Part1的电子密度从68%减少到14%，而Part2的电子密度从32%增加到86%，发生了明显的电荷转移。造成羰基上的氧原子电子密度增加，而羟基上的氧原子电子密度减少，氢键强度显著增强，为ESIPT过程的发生提供了可能性。其中，随着溶剂极性的增加，LUMO轨道上Part1上的电子强度百分比增加，Part2上的电子强度百分比减少。表明溶剂极性的增加，N*态的相应氢键强度降低，ESIPT过程变得更加困难。

3.3.3 ESIPT反应机理分析

图4使用B3LYP-D3/6-311+g（d，p）方法计算了三种溶剂中ESIPT反应的势能曲线及其相应的势垒。在基态下，质子转移反应是吸热过程，它们正向质子转移的势垒（14.10 kcal∙mol−1 ， 1 cal =4.1868 J） 远大于逆向质子转移势垒（3.35kcal∙mol−1）。相比之下，S1态下的正向ESIPT反应是放热过程，正向质子转移的势垒（～6.61 kcal∙mol−1）小于且接近逆向质子转移势垒（～7.85 kcal∙mol−1）。所以，质子转移反应倾向于S1态，由N*向T*转移。此外，溶剂极性的增加导致质子转移势垒升高，正向ESIPT反应变困难。图4d中计算得到的正向ESIPT 反应的吉布斯自由能（CYH ， −0.9457kcal∙mol−1；DEE，−0.7226 kcal∙mol−1；THF，−0.6363kcal∙mol−1）随着溶剂极性增大而变大，也进一步验证了正向ESIPT反应变困难。从图4的计算结果上，溶剂极性的增加导致逆向ESIPT反应（从T*回到N*）能垒也在增加，质子转移变困难。以上计算得到的热力学结果与实验测量的动力学结果一致。

D-HBF与之前对4’-N，N-二乙氨基-3-羟基黄酮的ESIPT机制研究16结论相似，从N态激发到N*态时偶极矩存在显著差异（如表5所示）。N*态相比于N态和T*态经历溶剂稳定化作用，溶剂极性的增加导致N*态能量相比于T*态降低更显著，有利于ESIPT化学平衡向N*态移动。

综上，氢键强度是决定不同溶剂中ESIPT反应驱动力的关键因素。在第一激发态中，氢键相互作用的程度随着溶剂极性的增加而减弱，导致激发态下正向和反向质子转移的能垒都增加。其中，N*态具有ICT特征，对溶剂极性更为敏感。随着溶剂极性的增加，ESIPT反应平衡向N*态移动。最终，溶剂极性的增加导致D-HBF的双重荧光强度比IN*/IT*降低，ESIPT反应被抑制。

4 结论

本研究采用实验与理论计算相结合的方法，探讨了溶剂环境对D-HBF的ESIPT影响。研究结果表明，D-HBF具有ESIPT行为，且具有双发射峰的特征，其强度比受溶剂调控。为了进阐明ESIPT机制，我们采用了DFT和TDDFT方法结合B3LYP泛函和6-311+g（d，p）基组进行理论计算。通过比较DHBF在不同溶剂中的基态（S0）和激发态（S1）之间的分子内氢键的键长和键角，确定ESIPT反应通过激发态氢键增强机制发生。此外，溶剂极性的增加，计算得到的S1状态下O–H伸缩模式的红外吸收频率变大，也进一步证明了激发态下氢键强度再减弱。前线分子轨道（FMOs）也显示了D-HBF具有电荷转移特征，表明ESIPT通过激发态氢键增强机制发生。为了进一步确认ESIPT发生机制，分别计算了D-HBF在S0和S1态下的势能曲线。计算结果表面，质子转移过程更倾向于在S1态发生，而溶剂的极性导致ESIPT势垒升高，质子转移变困难。综上所述，溶剂极性可以调控D-HBF的双发射荧光强度比（IN*/IT*），为D-HBF作为环境极性敏感的生物荧光探针的潜在应用奠定基础。