基于蛋白组学研究醋酸棉酚治疗子宫肌瘤的作用机制

关键词醋酸棉酚；子宫肌瘤；蛋白组学；生物信息学；作用机制

子宫肌瘤（uterinefibroid，UF）是女性子宫平滑肌形成的良性肿瘤，在育龄妇女中的发病率为20%～50%[1]，其致病因素复杂，受年龄、种族、激素、生活方式、家族史、遗传因素等影响[2]。相比手术的有创性，药物保守治疗是大多数UF患者更倾向的治疗方式，常用治疗药物包括激素和中药，但是激素只能暂时缓解症状，一旦停药，肌瘤可能会再次生长，且长期使用激素可能会引起一系列的副作用；中药治疗效果因人而异，且需要较长时间的治疗才能看到明显的效果[3]。因此，选择安全有效的治疗药物对UF具有重要意义。

醋酸棉酚（gossypolaceticacid，GAA）是一种多元酚醛类化合物，也是复方醋酸棉酚片的主要药效成分。相关研究显示，复方醋酸棉酚片在治疗UF、子宫内膜异位症等方面具有较好的效果[4―5]，但关于GAA在UF中的调控作用及机制尚不清楚。蛋白组学能够从细胞水平对蛋白质的组成进行分析，明确整个过程的变化规律及特征，可用于全面、定量描述蛋白质的表达及其在疾病或药物治疗影响下的变化[6]。基于此，本研究通过体外细胞实验，观察GAA对人UF细胞SK-UT-1增殖的调控作用，然后结合四维数据非依赖型采集（4D-DIA）蛋白组学技术挖掘差异蛋白并进行验证，以期为阐明GAA治疗UF的作用机制提供参考。

1 主要材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有CKX53型倒置显微镜（日本Olympus公司），DYY-7C型电泳仪、DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYCZ-40型电转仪（北京六一生物科技有限公司），ChemiDocTMXRS+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），ViiA7型实时荧光定量聚合酶链式反应仪（美国ABI公司），MultiskanFC型酶标仪、EASY-nLC1200型质谱系统、OrbitrapExploris480型高效液相色谱仪（美国ThermoFisherScientific公司）。

1.2 主要药品与试剂

CCK-8检测试剂盒（货号CK04）购自日本同仁化学研究所；GAA（纯度≥98.0%，货号A506218-0001）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；米非司酮（货号HY-13683，纯度99.83%）购自美国MCE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号分别为P0013B、P0010）均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；兔源N-myc下游调节基因1（N-mycdownstreamregulatedgene1，NDRG1）抗体、兔源表皮生长因子受体反馈抑制剂1（epidermalgrowthfactorreceptorfeedbackinhibitor1，ERRFI1）抗体、鼠源GAPDH抗体（货号分别为26902-1-AP、11630-1-AP、60004-1-Ig）均购自美国Proteintech公司；兔源CXC趋化因子配体3（CXCchemokineligand3，CXCL3）抗体（货号DF8554）购自美国Affinity公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G、山羊抗鼠免疫球蛋白G二抗（货号分别为111-035-003、115-035-003）购自美国Jackson公司。

1.3 细胞

人UF细胞SK-UT-1（货号CTCC-007-0320）购自浙江美森细胞科技有限公司；人子宫内膜细胞EEC（货号QS-H011）购自旗赛生物科技（武汉）有限公司。

2 方法

2.1 细胞增殖活性考察

取正常培养的SK-UT-1细胞，吸去原培养液，加入磷酸盐缓冲液（PBS）洗后加入胰蛋白酶消化3min后终止消化，以1000r/min离心5min，细胞沉淀用培养基重悬；取20μL细胞悬液加入20μL台盼蓝进行计数，以8000个/孔进行铺板（96孔板），细胞体积100μL；然后分为不同质量浓度（5、10、20、40、80、160μmol/L，浓度根据文献[7]设置）GAA组、对照组（含有细胞）和空白组（不含细胞），每组设置3个复孔，于5%CO2、37℃条件下培养24h。各孔加入10μLCCK8继续培养3h，采用酶标仪测定各孔光密度（opticaldensity，OD）值，并计算细胞存活率，细胞存活率（%）＝（给药组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100%。

2.2 4D-DIA蛋白组学分析

“2.1”项下实验结束后，向对照组、GAA组（80μmol/L）中加入含1mmol/LRIPA裂解缓冲液，冰上孵育5min；超声5min，以15000r/min离心10min，收集上清液，采用BCA法测定总蛋白浓度。取上述蛋白溶液，在37℃下用10mmol/L二硫苏糖醇还原45min，用50mmol/L碘乙酰胺烷基化15min；加入4倍体积的预冷丙酮，在－20℃下沉淀2h，离心，在37℃下用胰蛋白酶消化过夜。终止消化后，将样品在C18色谱柱上脱盐，真空浓缩后，用0.1%甲酸溶解，待上机检测。

采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法检测。将上述待测样品上样到分析柱IonOpticksAustralia（25cm×75μm，1.6μm）中进行分离；流动相A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脱（0～25min，2%B→22%B；25～30min，22%B→35%B；30～35min，35%B→80%B；35～40min，80%B）；柱温为50℃，上样量为200ng，流速为300nL/min。分离后的馏分真空离心浓缩后，采用质谱仪进行分析，检测方式为正离子模式，母离子扫描范围为m/z100～1700，毛细管电压为1500V，干燥气体速度为3L/min，干燥温度为180℃；利用ddaPASEF模式采集质谱数据，然后采用DIA-NN（v1.8.1）搜库软件，以Library-free方法搜库，预测谱图库，并利用该谱图库进行蛋白质分析以及质控评价（包括肽段长度分布、肽段数分布、肽段漏切位点数分布、主成分分析等，以保证结果符合要求）[6]，然后将相应数据过滤后用于后续的生物信息学分析。

2.3 生物信息学分析

基于“2.2”项下结果，以差异倍数（foldchange，FC）≥1.5或FC≤0.6667，且P值≤0.05筛选差异蛋白，并绘制差异蛋白统计柱状图；然后将每个差异蛋白的FC以2为底数取对数，P值以10为底数取对数的绝对值，绘制火山图[8]。另外，使用WoLFPSORT软件对差异蛋白进行亚细胞定位，并绘制饼图，然后对差异蛋白进行基因本体（geneontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）信号通路分析。

2.4 差异蛋白表达验证实验

为了进一步验证GAA在分子层面对UF的调控作用，选取FC排前3名的差异蛋白进行验证。将细胞分为正常组（用EEC细胞）、模型组（用SK-UT-1细胞）、阳性对照组（米非司酮，10μmol/L[9]，用SK-UT-1细胞）和GAA高、中、低浓度组（80、40、20μmol/L，浓度根据“2.1”项下结果设置，用SK-UT-1细胞），细胞密度为8000个/孔，每组设3个复孔。培养24h后，将细胞裂解、离心、定量后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以5%TBST封闭液室温封闭2h，加入NDRG1、ERRFI1、CXCL3、GAPDH蛋白一抗（稀释度均为1∶1000）于4℃条件下孵育过夜；以TBST洗膜，加入相应二抗（稀释度均为1∶10000）室温孵育2h；以TBST洗膜，经显色后，采用凝胶成像系统进行观察，然后以ImageJ软件进行分析，以GAPDH蛋白为内参，计算各目的蛋白的表达水平。

2.5 统计学方法

利用SPSS25.0软件进行数据处理，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 GAA对SK-UT-1细胞增殖活性的影响

由图1可知，与对照组比较，10～160μmol/LGAA组SK-UT-1细胞存活率均显著降低（P＜0.05）；GAA浓度大于80μmol/L时，细胞存活率均小于50%。因此，后续研究选择80、40、20μmol/L作为GAA的干预浓度。

3.2 4D-DIA蛋白组学分析和生物信息学分析结果

3.2.1 蛋白质量评估结果

肽段长度（图2A）结果显示，大部分肽段有7～20个氨基酸，符合基于酶解和质谱碎裂方式的一般规律，质谱鉴定到的肽段长度也符合质控要求。肽段数量分布和漏切位点数分布（图2B、2C）结果显示，肽段数量较多且漏切位点数为0的肽段占比较高（为72.99%），符合质控要求（肽段数量越多，表示该蛋白越可信；肽段漏切位点数为0的肽段越多，表示酶切越彻底，鉴定结果越可信）。主成分分析（图2D）结果显示，各组样本之间的蛋白差异明显，组内样本之间相关性明显，符合质谱上机标准。

3.2.2 差异蛋白分析结果

由图3A、3B可知，GAA组与对照组共获取了921个差异蛋白，其中上调蛋白254个、下调蛋白667个。

3.2.3 差异蛋白的亚细胞定位结果

结果显示，差异蛋白主要分布在线粒体、细胞核、细胞外基质、细胞质和细胞膜，具体见图4。

3.2.4 差异蛋白的GO分析和KEGG信号通路分析结果

选取GO分析中P值排前50名的条目绘制富集条目柱形图（见图5A），由图5A可知，生物过程主要集中在线粒体蛋白翻译、RNA聚合酶Ⅱ对转录的调控、蛋白翻译、凋亡、细胞粘连及分化；细胞组分主要集中在线粒体膜、基质、染色质、细胞膜；分子功能主要集中在核糖体的构建、转录因子与DNA的结合等。选取排前50名的KEGG信号通路绘制富集条目柱形图（见图5B），由图5B可知，信号通路主要为PI3K/AKT（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B）、MAPK（mitogen-activatedproteinkinase，促分裂原活化的蛋白质激酶）、TNF（tumornecrosisfactor，肿瘤坏死因子）、NF-κB（nuclearfactorκB，NF-κB）、AMPK（AMPactivatedproteinkinase，AMP活化的蛋白质激酶）、Ras信号通路，主要涉及细胞凋亡、衰老、运动等细胞过程。

3.3 GAA对差异蛋白表达的影响结果

选取FC排前3名的蛋白NDRG1、ERRFI1、CXCL3进行验证。与正常组比较，模型组细胞中NDRG1、CXCL3蛋白表达水平均显著升高，ERRFI1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和GAA各浓度组细胞中NDRG1、CXCL3蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），ERRFI1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。与阳性对照组和GAA高浓度组比较，GAA中、低浓度组细胞中CXCL3蛋白表达水平均显著升高，ERRFI1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与阳性对照组比较，GAA高、中、低浓度组细胞中NDRG1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。结果见图6。

4 讨论

GAA作为复方醋酸棉酚片的主要药效成分，在临床上对UF具有良好干预作用。本研究结果证实，GAA对人UF细胞SK-UT-1具有显著的抑制作用；进一步基于蛋白组学进行差异蛋白、KEGG信号通路、GO分析，结果显示，GAA组和对照组的差异蛋白较多，主要集中于细胞线粒体。线粒体是动物细胞除细胞核外唯一具有DNA的细胞器，线粒体功能异常是肿瘤发生、发展和转移的重要原因[10]。差异蛋白的GO分析结果显示，细胞过程主要为凋亡和衰老。相关研究发现，细胞凋亡、衰老与线粒体功能障碍密切相关[11]。KEGG信号通路分析结果显示，醋酸棉酚影响的信号通路主要有PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、AMPK信号通路、Ras信号通路，这些信号通路也与线粒体之间存在密切关系，可能在UF的发生、发展过程中发挥重要作用，如阻断Ras信号通路的激活，可抑制UF细胞的增殖和血管生成[12―15]。

进一步对GAA组与对照组的差异蛋白进行筛选，明确FC排前3名的蛋白为NDRG1、ERRFI1、CXCL3，这3个蛋白可能是GAA调控细胞增殖、凋亡的重要靶点。NDRG1是N-myc下游调节基因，在细胞核、细胞膜及线粒体中广泛存在，可参与细胞增殖、凋亡、脂质生物合成、应激反应、免疫调节、DNA修复、线粒体分裂等细胞过程；在肿瘤领域，NDRG1存在明显的组织特异性和功能多效性，在不同肿瘤中发挥促癌作用[16]。ERRFI1主要作用于表皮生长因子受体信号通路，其不仅可以直接与表皮生长因子受体结合，抑制表皮生长因子受体激酶活性，还可以抑制表皮生长因子受体信号通路下游的Ras/MAPK和PI3K/AKT信号通路的激活[17]。ERRFI1作为一种肿瘤抑制基因，其表达减少以及蛋白功能的丧失有助于癌症的发展[18]。CXCL3是CXC趋化因子亚家族的成员之一，在炎症反应、血管生成、肿瘤转移、免疫调节方面具有重要作用[19]，其表达水平升高会促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡[20]。本研究结果显示，相较于正常的子宫内膜细胞，SK-UT-1细胞中NDRG1、CXCL3蛋白表达水平均升高，ERRFI1蛋白表达水平降低；而经GAA干预后，上述蛋白表达水平均逆转。这提示GAA可能通过下调NDRG1、CXCL3蛋白表达，上调ERRFI1蛋白表达，抑制UF细胞的增殖、存活和侵袭。

综上所述，GAA对UF的改善作用可能涉及PI3K/AKT、MAPK、TNF等信号通路；其可通过下调NDRG1、CXCL3蛋白的表达，上调ERRFI1蛋白的表达，影响UF细胞的增殖和凋亡，从而改善UF的发生发展。本研究仍存在一些不足：蛋白组学虽然能够提供大量关于蛋白表达变化的信息，但单纯依赖蛋白组学可能无法全面揭示GAA治疗UF的复杂机制。未来的研究需要综合运用多种研究方法验证结果，深入揭示GAA的治疗机制，为UF的临床治疗提供更有效的方法。