胶原蛋白肽-焦磷酸铁复合物的构建及其补铁效果评价

摘 要：铁复合物是一种将铁元素与食品大分子结构进行组装的新型铁强化剂，具有化学稳定性和生物利用度高的优点.本课题采用均质、超声和透析处理，在焦磷酸铁（FP）的合成过程中，引入胶原蛋白肽（CPs）.红外光谱测定发现，该方法成功制得CPs-FP复合物.与FP相比，CPs-FP的胃肠释放率提高.缺铁性贫血大鼠实验表明，CPs-FP能够有效改善大鼠体重、血红蛋白含量、组织铁含量和其他指数，呈现浓度依赖效应.同等剂量下，CPs-FP复合物具有更高的生物利用度.

关键词：焦磷酸铁； 胶原蛋白肽； 铁复合物； 胃肠消化； 缺铁性动物

中图分类号：TS201.4

文献标志码： A

Construction of collagen peptides-ferric pyrophosphate complex and its iron supplementation effect

LIU Ning1，2， WANG Wei2， HE Ren-jie2， YAO Xiao-lin2， ZHANG Kun1*

（1.Ferguson （Wuhan） Biotechnology Co.， Ltd.， Wuhan 430056， China; 2.School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：Iron-loaded complex is a new type of iron fortifying agent that assembles iron element with food macromolecular.It has the advantages of chemical stability and high bioavailability.Through homogenization，ultrasound and dialysis treatment，collagen peptide （CPs） was introduced into the synthesis process of ferric pyrophosphate （FP）.The result of FTIR showed that the CPs-FP complex was successfully prepared by this method.The gastrointestinal release rate of CPs-FP was higher than that of FP.In the experiment of iron deficiency anemia rats，CPs-FP can effectively improve the body weight，hemoglobin content，tissue iron content and other indexes，showing a concentration-dependent effect.At the same dose，CPs-FP complex exhibited higher bioavailability.

Key words：ferric pyrophosphate; collagen peptide; iron-loaded complex; gastro-intestinal digestion; iron deficiency animal

0 引言

从单细胞细菌到人类等多细胞生物，铁都是维持生命最重要的金属元素之一［1］.在全球贫血人口中，缺铁被确定为贫血的主要原因，使缺铁性贫血成为一个重要的全球健康问题［2］.焦磷酸铁（Ferric pyrophosphate，FP）是一类常见的无机铁强化剂，因其颜色较浅，不含铁腥味，被广泛应用于食品和饲料添加剂.在储存过程中，焦磷酸铁易使脂肪和蛋白发生氧化，影响乳品或谷物产品的品质和保质期.同时，焦磷酸铁在胃液中的溶解性较差，限制了其生物利用度.针对上述问题，对焦磷酸铁进行包埋，能够减少与其他食品成分的相互作用，防止感官劣变［3］，但这可能会导致产品铁含量下降，生物利用度偏低.通过物理手段将焦磷酸铁粒径降至纳米级，增加比表面积，可提高其在胃液中的生物利用度［4］.胶原蛋白是一种由多肽链缠绕形成三股螺旋的大分子结构性蛋白质，水解法可破坏胶原蛋白的螺旋结构，生成分子量在300～6 000 Da之间的胶原蛋白肽（Collagen peptides，CPs），通常由3～20个氨基酸组成［5］.多肽金属螯合物是由多肽与金属离子通过配位共价键等形成的配合物，具有多种特殊的生物活性［6］.目前，具有较高铁亲和力的多肽制备及提高铁螯合肽生物利用度的方法研究受到广泛关注［7］.

本课题在FP的合成过程中引入CPs，借助均质、超声和透析等物理处理，获得胶原蛋白肽-焦磷酸铁复合物（CPs-FP），对其结构和稳定性进行研究，并建立缺铁性贫血大鼠模型，评价了CPs-FP的补铁效果，以期为新型补铁剂的开发利用提供技术参考和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料

牛皮胶原蛋白肽（800～1 200 Da）：福格森（武汉）生物科技股份有限公司自制；焦磷酸钠、六水合氯化铁、焦磷酸铁：上海麦克林生化科技有限公司；七水硫酸亚铁、盐酸羟胺、邻菲罗啉：天津市科密欧化学试剂有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：国药集团化学试剂有限公司；透析袋（MWCO 1000 Da）：上海源叶生物科技有限公司；血红蛋白测试液、血清铁测定试剂盒、总铁结合力测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；大鼠原卟啉ELISA试剂盒：上海纪宁实业有限公司.其他试剂均为分析纯.

1.1.2 实验动物

三周龄SPF级SD大鼠48只，雄性，体重50～60 g，由西安医学院提供.实验动物生产许可证号：SYXK（陕）2022-003.动物置于不锈钢饲养箱内（避免铁元素干扰），环境温度控制在25 ℃左右，正常摄食，自由饮用去离子水，自然周期光照.标准饲料（铁含量gt;250 mg/kg）、垫料及耳标购自中科生命（北京）有限公司，缺铁饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司（铁含量12 mg/kg）.

1.1.3 主要仪器

IKA-T25型高速剪切机：广州仪科实验室技术有限公司；SCIENTZ-Ⅱ D型超声波细胞粉碎机、SCIENTZ-10N/A型冷冻干燥机：宁波新芝生物科技有限公司；Phenom Pro型台式扫描电镜：复纳科学仪器（上海）有限公司；VECTOR-22型傅里叶红外光谱仪：布鲁克（北京）科技有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；Multiskan Skyhigh型酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 胶原蛋白肽-焦磷酸铁复合物的制备

将5.4 g六水合氯化铁加入40 g去离子水中，搅拌溶解至澄清黄色溶液.将1.86 g CPs和4.65 g焦磷酸钠加入100 g去离子水中，搅拌至无色透明溶液，均质（16 000 r/min，8 min）过程中滴加氯化铁溶液.滴加完毕后，使用超声波破碎仪进行超声处理（500 W，20 kHz，10 min），得到白色悬浮浊液.使用1 000 Da透析袋在4 ℃对浊液进行透析，冷冻干燥，粉碎得到CPs-FP.经计算，得率为85.23%.

1.2.2 扫描电镜观察

将少量FP、CPs和CPs-FP粉末分别涂抹在导电胶上，经金属镀膜后，使用扫描电镜观察其微观形貌，拍摄图像.

1.2.3 红外光谱分析

将干燥的FP、CPs和CPs-FP粉末分别与干燥至恒重的溴化钾按1∶200质量比混合，研磨后压片，使用傅里叶红外光谱仪测定其红外光谱，波数范围为4 000～400 cm-1，对所得图谱进行分析.

1.2.4 模拟胃肠消化

参考Nalinanon等［8］的方法，略有改动.在胃肠消化阶段中，每次取样后滴加几滴1 mol/L NaHCO3终止消化，冷却后取上清液，通过邻菲罗啉比色法测定上清液铁含量，以可溶性铁含量评价CPs-FP在胃肠道的消化特性.计算公式如下：

可溶性铁含量（%）=X1X2×100

（1）

式（1）中：X1-消化液中铁质量浓度，mg/mL；X2-理论上铁全部溶出时质量浓度，mg/mL.

1.2.5 胶原蛋白肽-焦磷酸铁复合物的补铁效果评价

（1）缺铁大鼠模型建立

对SD大鼠，经3 d适应期后，测量体重和血红蛋白（Hb）作为基础数据.以大鼠Hblt;90 g/L为缺铁性贫血模型建立成功的标准［9］.

（2）大鼠恢复实验

随机将造模成功大鼠均匀分为低铁对照组，FP组和低、中、高剂量CPs-FP组.实验期间各组动物按表1中数据进行持续灌胃，每天10∶00灌胃一次，灌胃容积为5 mL/kg·bw，每周测定体重及血红蛋白数据，并根据体重更新灌胃的给药量［9］.给药4周后，记录体重，处死所有实验动物，测定各项血液学指标及脏器重量，评估CPs-FP的补铁效果.

（3）指标采集

采血前，实验动物禁食12 h.每周测定血红蛋白水平时，采用尾静脉抽血法；实验结束时，以眼球切除法大量取血.采血过程中，舍弃前两滴血液，将剩余的血液样本分别装入含EDTA的抗凝管和EP管中.EP管中血液样本经过30 min室温静置后，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液作为血清，并于4 ℃冰箱中保存备用.取血后迅速解剖并切除各器官，用生理盐水洗净大鼠脏器，擦干表面水分，使用电子天平称重.将样本编号装入液氮预冷的冻存管中，随后转移至-80 ℃超低温冰箱保存.通过式（2）计算各组大鼠的脏器指数：

脏器指数（%）=脏器重量（g）大鼠体重（g）×100

（2）

将肝脏和脾脏解冻后，用去离子水冲洗3次.剪碎后加入硝酸-高氯酸（5∶1）进行湿法消解.待消化完全后，采用邻菲罗啉比色法测定肝脏和脾脏组织消解液中铁含量.按照试剂盒操作说明，检测血红蛋白含量、血清铁水平以及总铁结合力，并测定实验大鼠红细胞内游离原卟啉含量.

1.3 数据处理与分析

所有实验均进行3次或3次以上的平行试验，采用SPSS 23.0对各试验组的数据结果进行统计学分析.

2 结果与讨论

2.1 铁复合物的结构表征

2.1.1 扫描电镜观察

图1为FP、CPs和CPs-FP的SEM图像.各样品在微观形态上有明显不同，FP为粒状或聚集块状，尺寸不均；CPs呈现不规则的颗粒或大块片状.复合物CPs-FP颗粒分布较为分散、均匀，颗粒之间的聚集程度较低.表明超声和均质处理能够导致其微观结构发生改变，降低铁复合物颗粒的分散程度，这有助于提高CPs-FP在水溶液中的悬浮稳定性.刘艳等［10］采用SEM对牡蛎肽及牡蛎肽锌螯合物进行观察发现，经螯合后，样品微观结构由表面平滑的大体积块状变为碎散小块.

2.1.2 红外光谱分析

FP、CPs和CPs-FP的红外光谱如图2所示.CPs在1 400 cm-1附近的特征峰为氨基酸残基侧链基团-COOH伸缩振动引起的吸收峰［11］.与焦磷酸铁反应后，1 446 cm-1和1 539 cm-1附近的吸收峰出现明显移动，在CPs-FP中红移至1 452 cm-1和1 552 cm-1.可以推测氨基和铁离子通过共价键进行了连接，发生配位反应，这与牡蛎肽亚铁螯合物［12］和桃仁多肽螯合亚铁［13］的红外光谱结果类似.红外光谱中900～714 cm-1、1 250～998 cm-1和630～495 cm-1附近的吸收峰分别归属于FP的P-O-P伸缩，P-O振动和形变［14］.与FP相比，CPs-FP在多区域吸收峰的位置、吸收相对强度均发生了明显变化，表明该制备过程不是FP和CPs的简单混合，而是生成了一种有别于FP的复合物.FP与CPs间适度的相互作用力，一方面将有助于提高铁在消化道中的稳定性；另一方面，复合物借助肽转运系统进入肠细胞后，在肠细胞液的作用下易释放铁离子，从而促进铁的吸收利用［12］.

2.2 铁复合物的模拟胃肠消化特性测定

铁的吸收主要发生在十二指肠和空肠上段的粘膜层.铁强化剂一般应在胃肠道内被消化并转运至吸收部位.FP是一类不溶于水且难溶于稀酸的化合物，在胃液中溶解度低，降低了作为补铁剂的效果，并进一步限制了其生物利用度和营养价值.由图3可知，在胃液环境中，FP中的铁含量溶出缓慢，经80 min消化，可溶性铁含量为40.63%.据报道，FP在pH 1.0环境中，溶解度为0.5 mmol/L；当pH上升到2.0，其溶解度骤降为0.02 mmol/L［15］.本实验中，与FP相比较，CPs-FP经40 min消化后，胃液中的可溶性铁含量逐渐提升.这可能是因为粒径降低后，反应比表面积增大，可以更好地与H+接触，提高了其溶出率，增加了生物利用度.

由图3可知，在肠液pH条件下，FP和CPs-FP的溶解性均有所提高.Tian等［15］发现，FP在pH环境为7～8时，溶解度较胃液中有所提升.CPs-FP在120 min左右基本溶出完毕，显著快于FP；随后出现下降趋势.可能是因为H+浓度下降，pH升高使释放出的游离铁离子与酸解后CPs残基发生螯合反应.同时，肠液较高pH环境下，铁离子容易与OH-生成氢氧化铁沉淀，降低了可溶性铁含量.这与关爽等［16］和Zhang等［17］的研究结论类似.

2.3 铁复合物的补铁效果评价

2.3.1 铁复合物对大鼠生长状况的影响

表2显示，动物实验开始时，各组大鼠的初始体重无显著差异（pgt;0.05）.随着缺铁干预时间延长，观察到缺铁性模型组大鼠出现了贫血特征，表现为皮肤、眼睛、耳朵和脚爪苍白，毛发粗糙、稀疏和发黄，体重减轻，进食量和活动量下降，粪便颜色偏黄，反应迟钝和精神萎靡等现象，并有相互撕咬和啃咬鼠笼的行为.在实验第4周时，各实验组大鼠体重均与空白对照组存在显著差异（plt;0.05），体重增幅显著低于空白对照组.这表明铁在机体生长发育中起着关键作用，缺铁性贫血抑制了大鼠身体发育速度.

经摄入FP和CPs-FP补铁后，大鼠体重增长速度有所提高.在实验第6周时，低、中、高剂量CPs-FP组大鼠体重与低铁对照组有显著差异（plt;0.05）.喂食8周后（补铁实验结束），高剂量组大鼠体重与FP组存在显著差异（plt;0.05），但与空白对照组无显著差异（pgt;0.05）.结果表明，CPs-FP能够有效恢复缺铁性贫血大鼠的正常体重，并呈现浓度依赖效应.

2.3.2 铁复合物对大鼠血红蛋白含量的影响

由表3可知，经过4周建模，各模型组与空白对照组的血红蛋白（Hb）含量出现显著性差异（plt;0.05）.除空白对照组外，其他各组的Hb均小于90 g/L，说明造模成功.经FP和CPs-FP干预后，大鼠Hb含量得到明显改善.从第5周开始，低、中、高剂量CPs-FP组与低铁对照组的Hb含量相比，出现显著性差异（plt;0.05）.8周补铁结束后，中、高剂量CPs-FP组的Hb含量均与FP组差异明显，各CPs-FP剂量组之间的Hb含量也出现显著性差异，表明CPs-FP可有效改善大鼠缺铁性贫血.Srinivasu等［14］发现FP超微粉的生物利用率与硫酸亚铁相近.Wegmüller等［18］研究表明，FP的粒径显著影响了其生物利用度.本实验经均质、超声处理后CPs-FP的粒径降低，提高了其生物利用率及对大鼠的补铁效应.

总铁结合力（Transferrin，TF）是指血清中转铁蛋白与铁离子形成复合物的最大能力，反映了血浆中TF的含量和饱和度.缺铁时，总铁结合力会升高［19］.通过表4可知，经FP和CPs-FP干预后，FP组和低、中、高剂量CPs-FP组的总铁结合力较造模后分别下降了15.77%、17.58%、20.90%和21.96%.补铁后，机体内铁水平升高导致血清铁增加，血红蛋白合成增强，转铁蛋白生成抑制和血清总铁结合力降低.

红细胞内游离原卟啉（Free erythrocyte protoporphyrin，FEP）与二价铁络合成血红素，测定血液中游离原卟啉的含量可评估血红蛋白合成情况.由表4可知，恢复（补铁）实验结束后，低铁对照组的大鼠FEP含量均高于其他组（plt;0.05）.FP组和低、中、高剂量CPs-FP组的FEP含量，较造模后分别下降了7.79%、5.65%、12.82%和21.90%.随着CPs-FP剂量增大，FEP含量下降越明显.因此，给予FP和CPs-FP可使大鼠血液中该指标达到正常水平，有效改善FEP较高的问题.

2.3.3 铁复合物对大鼠组织铁含量的影响

一般来说，肝脏铁含量可以表征机体的总铁负荷，而脾脏铁含量能够反映机体的红细胞破坏程度［20］.CPs-FP对大鼠肝脏、脾脏组织铁含量的影响如表5所示.各恢复组的肝脏铁含量与低铁对照组相比，均有显著提高（plt;0.05），表明FP和CPs-FP干预可有效促进肝脏铁含量的恢复，各剂量CPs-FP组间的肝脏铁含量也呈现显著差异.对于脾脏铁含量，FP组与低剂量CPs-FP组较接近，各剂量CPs-FP组与空白对照组相比均差异明显（plt;0.05）.综合来看，CPs-FP对大鼠肝脏、脾脏铁含量改善存在浓度依赖性.

3 结论

借助均质、超声和透析等物理手段，本课题在FP合成过程中引入CPs，成功制备了一种CPs-FP复合物.结构分析表明，CPs-FP为通过配位作用形成的复合物.在模拟胃肠环境下，CPs-FP的铁释放速率快于FP.通过缺铁性贫血大鼠模型证实，补充CPs-FP能够使贫血大鼠体重逐渐恢复，提高血红蛋白和血清铁含量，降低血清铁总结合力及红细胞内游离原卟啉水平，并有效提升肝脏、脾脏组织铁含量，改善机体内的铁储存.相较低剂量组，中、高剂量CPs-FP对缺铁性贫血大鼠的纠正时间更短，见效速度更快.试验采用缺铁性贫血动物模型对CPs-FP的补铁效果进行了初步评价，后续将开展不同来源胶原蛋白肽与其他铁复合物的补铁提升机制研究.

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【责任编辑：蒋亚儒】