植物同源域指蛋白6对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响

【摘要】目的 探讨植物同源域指蛋白6（PHF6）对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响，为临床诊疗提供参考。方法 根据癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析PHF6在人正常肝脏和肝癌组织的表达情况，以及其表达对300余例肝癌患者近十年生存率的影响。比较siNC组（转染PHF6无义序列）和siPHF6组（转染siRNA-PHF6）细胞PHF6 RNA表达水平，利用划痕和Transwell实验检测两组细胞迁移能力，通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测两组细胞上皮间质转化（EMT）相关基因表达情况。结果 PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象，高表达PHF6患者存活率降低。转染48 h后，siPHF6组细胞中PHF6 RNA表达水平低于siNC组（P=0.0016）。划痕后12、24、48、72 h，siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组，siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组。与siNC组相比，siPHF6组细胞神经钙黏蛋白（CDH2）、纤连蛋白（FN1）的表达水平均降低，CDH1的表达水平升高（Plt;0.0001、Plt;0.0001、P=0.0018）。结论 沉默PHF6可显著抑制肝癌细胞的迁移和EMT进程，靶向PHF6治疗肝癌具有应用前途。

【关键词】植物同源域指蛋白6；肝癌；Hep-G2；上皮间质转化

【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2096-2665.2025.02.0045.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2025.02.014

肝癌是全球死亡率排名第三的癌症，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是原发性肝癌的主要类型，占85%～90%[1-2]。目前，肝切除手术和肝移植能显著延长早期HCC患者的生存时间，但晚期患者复发率高、预后较差[3-4]。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是指上皮细胞转化为具有迁移能力的间充质细胞的过程。在这一过程中，上皮细胞逐渐失去黏附性，并明显表现出间充质细胞的特征，即细胞角蛋白Cytokeratins、上皮细胞钙黏蛋白（CDH1）等上皮细胞标志物的表达下调，神经钙黏蛋白（CDH2）、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（FN1）等间充质细胞标志物的表达增强[6]。癌症分子靶向治疗对治疗肝细胞癌具有重要临床意义。植物同源域指蛋白6（PHF6）是一种位于细胞核的染色质结合调节蛋白，具有转录调控功能。该基因位于人类染色体Xq26.3，属于X连锁基因，其突变在Börjeson-Forssman-Lehmann综合征中被发现[7-8]。 PHF6几乎表达于所有组织，对神经发育和造血很重要。在造血干细胞中敲除PHF6，可增加细胞自我更新能力，驱动血癌发生，因此PHF6被认为是一种抑癌基因[9-10]。敲除PHF6损害细胞增殖使其停滞在G（2）/M期，表明PHF6缺乏导致细胞DNA损伤的积累[11]。然而， PHF6是否影响肝癌生长和转移及作用机制尚未报道。基于此，本研究探究PHF6对肝癌细胞Hep-G2迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和分组 取Hep-G2肝癌细胞株（购自美国模式培养保藏中心），在饱和湿度细胞培养箱内培养（5% CO2、 37 ℃），培养基含有10%胎牛血清（FBS）（购自Sigma公司）和1%青链霉素的DMEM（购自Gibco公司）。细胞融合率达≥80%时用0.25%的胰酶（购自Gibco公司）37 ℃消化1 min后传代。实验分为siNC组（转染 PHF6无义序列）、 siPHF6组（转染siRNA-PHF6），每组使用的细胞数均为8×104个/ml细胞，每组设置3组重复实验。

1.2 转染PHF6基因 将8×104个/ml Hep-G2细胞接种于6孔板，每孔2 mL培养液，培养8～12 h，融合率达40%进行转染实验。将转染试剂 Lipofectamine ® RNAiMAX Reagent （购自Invitrogen公司）9 µL稀释于150 µL Opti-MEM® Medium中，同时将2 µL（30 pmol）siRNA 储存液加入150 µL opti-MEM® Medium中混合，室温孵育5 min 后将二者混匀， 4 ℃ 孵育15 min后滴加到对应孔中，培养6 h后更换培养液， 24～48 h后进行后续实验。 siRNA-PHF6核酸序列如下：正义链， 5＇-GGCCUACAAGACAGCGCAATT3＇-；反义链：5＇-UUGCGCUGUCUUGUAGGCCTT3＇-，由金拓思（武汉）生物科技有限公司进行设计并合成。

1.3 划痕实验 将转染后的siNC组和siPHF6组细胞进行培养，细胞融合度≥90%时用10 µl枪头垂直划痕，随后用磷酸盐缓冲液（购自Gibco公司）清洗细胞，去除杂质和脱落的细胞，于培养0、 12、 24、 48、 72 h拍照记录相同位置细胞的迁移变化，统计不同组别间细胞迁移差异。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应 在6孔板的每孔Hep-G2细胞中添加500 µl Trizol裂解液（购自TAKARA）以提取RNA，随后测定提取RNA的浓度，并通过凝胶电泳实验对其质量进行检测。利用PrimeScriptTMII cDNA Synthesis Kit（购自TAKARA）进行反转录，稀释反转录产物cDNA，以此作为实时荧光定量聚合酶链式反应的模板。检测两组细胞基因表达变化，实时荧光定量聚合酶链式反应引物序列，见表1。反应条件：起始95 ℃、 5 min；随后变性温度为95 ℃，维持 15 s，退火温度为60 ℃，维持30 s，此过程共进行40个循环。根据2-△△CT方法计算基因表达差异， 18S作为内参。

1.5 Transwell迁移实验 使用Transwell小室（孔径8 μm，购于Corning公司）进行迁移实验，转染后的细胞重悬于200 μL不含血清的DMEM溶液中，然后接种于上室。下室加入500 μL含10 % FBS的DMEM培养基作为催化剂。 37 ℃孵育24 h后，将已迁移至下室的细胞用100%甲醇在室温下固定30 min，利用0.5%结晶紫溶液进行30 min染色。对染色细胞进行观察，显微镜拍照。

1.6 数据统计 使用GraphPad Prism 9软件对实验数据进行统计分析并绘图，数据表示为（mean±SEM）；两组间比较进行Student t-test分析；对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中患者生存率进行对数秩检验分析。0.01lt;Plt;0.05标记为*， 0.001lt;Plt;0.01标记为**， Plt;0.001标记为***，Plt;0.0001标记为****。

2 结果

2.1 TCGA数据库肝癌患者存活率分析 PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象，见图1-A；高表达PHF6患者存活率降低，见图1-B、图1-C。

2.2 两组细胞PHF6 RNA表达水平比较 转染48 h后， siPHF6组细胞PHF6 RNA表达水平低于siNC组（P=0.0016），见图2。

2.3 划痕、Transwell实验结果分析 划痕后12、 24、 48、 72 h， siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组，见图3-A、图3-B。 siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组，见图3-C。

2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应分析结果 与siNC组相比， siPHF6组细胞CDH2、 FN-1的表达水平降低， CDH1的表达水平升高（Plt;0.0001、 Plt;0.0001、 P=0.002），见图4。

3 讨论

PHF6的体细胞功能突变在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）中非常普遍，也存在于急性骨髓白血病（acute myeloid leukemia，AML）中，且敲除PHF6基因的造血干细胞（HSC）的重建和自我更新能力增强，这均表明PHF6可能是一种抗癌基因[12-14]。然而，PHF6在乳腺癌和结直肠癌中显著高表达，提示PHF6可能参与其他恶性肿瘤，本研究将探讨其在肝癌中的作用机制。

本研究结果显示，PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象，高表达PHF6患者存活率降低；转染48 h后，siPHF6组细胞中PHF6的RNA表达水平低于siNC组；划痕后12、24、48、72 h，siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组，siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组；与siNC组相比，siPHF6组细胞CDH2、FN-1的表达水平降低，CDH1的表达水平升高。分析原因为，EMT是指上皮细胞失去相互连接和极性，转化为间质细胞的现象。这一过程的激活是上皮癌细胞获得恶性表型的核心机制，也是癌症转移和侵袭的重要环节[15]。因此，抑制EMT会干扰肿瘤的进展。敲低PHF6可能通过上调E-cadherin和下调N-cadherin和Fibronectin-1来抑制EMT过程，继而肝癌细胞Hep-G2细胞的迁移能力减弱。

此外， PHF6能招募组蛋白赖氨酸甲基转移酶SUV39H1至rDNA（核糖体DNA）区域，并借助SUV39H1的三甲基化酶活性来提升rDNA区域组蛋白H3的9位赖氨酸残基甲基化（H3K9me3）的水平，从而抑制rDNA转录。敲低PHF6则能够通过促进 rDNA的转录，进而增强细胞增殖和肿瘤生长[16]。但在T-ALL和AML的小鼠动物模型中，敲低PHF6后肿瘤增长速率却加快；而在小鼠的急性B细胞淋巴白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）模型中，通过慢病毒技术敲低PHF6后，观察到肿瘤的增长速率显著减缓[17]。本研究证明敲低PHF6可抑制肝癌细胞的迁移，进而起到治疗肝癌的作用，但这是否也是PHF6作为转录因子调控表观遗传进程来实现的，仍需进一步研究。

综上所述，沉默PHF6可显著抑制肝癌细胞的迁移和EMT进程，靶向PHF6治疗肝癌具有应用前途。通过基因编辑技术降低PHF6的表达或开发PHF6的小分子抑制剂，特异性地降低PHF6的表达或功能，从而抑制肝癌细胞的生长和转移，可作为肝癌治疗的新思路。

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