SYT7调控Hedgehog/Gli信号通路对胶质母细胞瘤进展的影响

[摘要]"目的"探讨人突触结合蛋白Ⅶ（synaptotagmin-7，SYT7）通过调控Hedgehog/Gli信号通路对胶质母细胞瘤进展的影响。方法"通过构建并转染短发夹RNA（short"hairpin"RNA，shRNA）慢病毒载体，利用定量反转录聚合酶链反应（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）分析SYT7在人脑胶质瘤U87细胞系中的表达，采用蛋白质印迹和qRT-PCR分析U87细胞中SYT7"shRNA的敲低效率。通过细胞计数、细胞周期分析和动物实验验证SYT7在胶质母细胞瘤中的作用。结果"qRT-PCR分析显示SYT7在U87细胞系中的表达高于正常脑细胞系。蛋白质印迹和qRT-PCR分析证实SYT7"shRNA在U87细胞中的有效敲低。细胞计数显示SYT7"shRNA的表达通过慢病毒载体下调SYT7，抑制U87细胞的生长；流式细胞术证实细胞周期阻滞。此外，基因富集分析和蛋白质印迹发现SYT7通过促进p53磷酸化与Hedgehog/Gli信号通路相关，进而在胶质母细胞瘤中发挥作用。结论"SYT7通过调控Hedgehog/Gli信号通路促进胶质母细胞瘤的生长，因此SYT7可能是治疗胶质瘤的潜在靶点。

[关键词]"突触结合蛋白Ⅶ；p53；胶质母细胞瘤

[中图分类号]"R473.73""""""[文献标识码]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.33.004

Effect"of"SYT7"regulation"of"Hedgehog/Gli"signaling"pathway"on"the"progression"of"glioblastoma

XIAO"Bing

Department"of"Neurosurgery，"the"Second"Affiliated"Hospital"of"Nanchang"University，"Nanchang"330006，"Jiangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effect"of"synaptotagmin-7"（SYT7）"on"the"progression"of"glioblastoma"by"regulating"Hedgehog/Gli"signaling"pathway."Methods"The"expression"of"SYT7"in"U87"cell"line"was"analyzed"by"quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction"（qRT-PCR）"and"transfection"with"short"hairpin"RNA"（shRNA）"lentiviral"vector."Western"blotting"and"qRT-PCR"were"used"to"analyze"the"knockdown"efficiency"of"SYT7"shRNA"in"U87"cells."Cell"counting，"cell"cycle"analysis，"and"animal"studies"confirm"the"role"in"glioblastoma."Results"qRT-PCR"analysis"showed"that"the"expression"of"SYT7"in"U87"cell"line"was"higher"than"human"normal"glial"cell"line."Western"blotting"and"qRT-PCR"analysis"showed"low"knockdown"efficiency"of"SYT7"shRNA"in"U87"cells."Cell"counts"showed"that"the"lentiviral"vector"expressing"SYT7"shRNA"down-regulated"SYT7"and"inhibited"the"growth"of"U87"cells."Flow"cytometry"confirmed"cell"cycle"block，"gene"enrichment"analysis"and"Western"blotting"revealed"that"SYT7"was"associated"with"Hedgehog/Gli"signaling"pathway"by"promoting"p53"phosphorylation."It"was"further"demonstrated"in"glioblastoma"by"animal"experiments."Conclusion"The"results"of"this"study"suggest"that"SYT7"promotes"glioblastoma"growth"by"regulating"the"Hedgehog/Gli"signaling"pathway，"so"SYT7"may"be"a"potential"therapeutic"target"for"glioma.

[Key"words]"Synaptotagmin-7;"p53;"Glioblastoma

胶质母细胞瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，其整体预后较差，复发率较高[1]。胶质母细胞瘤的确切发病机制尚不清楚[2]。人突触结合蛋白Ⅶ（synaptotagmin-7，SYT7）是突触结合蛋白（synaptotagmin，SYT）家族中的一员，该家族包含17个亚型，是细胞分泌过程中钙信号通路的受体，参与钙依赖性跨膜转运[3-5]。研究表明SYT7可调节细胞分化、凋亡、细胞因子活性、转录调控和胺类生物合成，参与溶酶体介导的修复，并诱导细胞凋亡[6]。SYT7作为溶酶体分泌的细胞外激活剂，与多种疾病相关，包括自身免疫性肌炎、糖尿病、炎症性关节炎、肺纤维化等。

研究显示Hedgehog/Gli信号通路与皮肤基底细胞癌、胃肠道肿瘤、前列腺癌、胰腺癌和肺癌的形成有关[7]。该信号通路由靶细胞膜上的两个受体Patched和Smoothened控制[8]。核转录因子Gli在这一通路中发挥关键作用[9]。Gli有3个同源基因，分别编码Gli1、Gli2和Gli3。其中，Gli1因其与胶质瘤的发生有关且被首次命名[10]。随着Hedgehog信号通路的激活，Gli1相关的下游靶基因（如n-myc、CyclinD1、Foxm1、bcl-2）的表达发生变化，从而影响胶质瘤细胞的生物学行为[11]。

p53作为肿瘤抑制基因在抑制胶质瘤进展中发挥重要作用[12]。P53蛋白可防止细胞癌变，维持基因组稳定，避免突变。研究表明p53与Gli1密切相关，p53通过调节Gli1蛋白水平抑制Gli1活性[13]。笔者推测SYT7通过调控p53介导的Hedgehog/Gli信号通路参与胶质母细胞瘤的发生发展，p53可能是SYT7调控Hedgehog/Gli信号通路的关键桥梁。为验证这一推测结果进行本研究，并报道如下。

1""材料与方法

1.1""材料和试剂

DMEM基础培养基购自武汉赛维尔公司；SYT7基因阴性对照（5′-TCACCGTGAAGATCATGAA-3′）购自上海基因化学有限公司；定量反转录聚合酶链反应（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）检测试剂盒购自日本Takara公司；SYT7引物购自上海基因化学有限公司；U87细胞系和正常脑细胞系为本实验室保有。4周龄雄性SCID小鼠购自北京维通利华生物科技有限公司，饲养于SPF级实验动物中心。动物实验符合3R原则，经南昌大学批准许可[许可证号：SYXK（赣）2021-0004]。本研究经南昌大学第二附属医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：NCULAE-20221031035）。

1.2""细胞培养

细胞于37℃、5%"CO2条件下进行常规传代培养。

1.3""RNA提取和qRT-PCR分析

使用短发夹RNA（short"hairpin"RNA，shRNA）转染U87细胞48h，用TRIzol（赛默飞世尔科技）试剂提取总RNA。使用qRT-PCR检测试剂盒按说明书要求检测SYT7"mRNA表达水平。SYT7的定量聚合酶链反应（quantitative"PCR，qPCR）采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase，GAPDH）为内参。SYT7正向引物：5′‐ACTCCATCATCG"TGAACATCATC‐3′，反向引物：5′‐TCGAAGGCGA"AGGACTCATTG‐3′；GAPDH正向引物：5'-TGACTT"CAACAGCGACACCA-"3'；反向引物：5'-CACCCTGT"TGCTGTAGCCAAA-3'。采用生物系统7300荧光定量PCR系统，qPCR分析采用Takara"Bio公司的SYBR"PrimeScript"qPCR试剂盒。反应混合物在95˚C条件下孵育30s，在95˚C条件下扩增45次，扩增时间分别为5s，60˚C条件下扩增30s，72˚C条件下扩增60s，72˚C条件下扩增7min。通过2–ΔΔCq方法计算SYT7"mRNA的相对表达量，用GAPDH"mRNA表达量进行归一化[14]。

1.4""shRNA慢病毒载体的构建及转染

表达shRNA的慢病毒和SYT7基因阴性对照（5′-TCACCGTGAAGATCATGAA-3′）购自上海基因化学有限公司。将以上shRNA克隆到具有AgeI/EcoRI位点的pgcsil-绿色荧光慢病毒载体中，获得重组慢病毒shRNA的表达载体。将U87MG胶质瘤细胞接种于6孔板中，每孔种植4×105个细胞。用shSYT7慢病毒（4×108TU/ml×2.5μl）或阴性对照（8×108TU/ml×1.25μl）感染6孔板细胞，分为shSYT7组和对照组。感染后5d采用qPCR检测shRNA-SYT7载体的敲除效率。

1.5""细胞增殖

转染48h后，用胰蛋白酶消化U87细胞，以5×103个/孔的密度接种于12孔板。shSYT7组和对照组在显微镜下计数5d。

1.6""蛋白质印迹分析

转染48h后收集细胞，在Beyotime缓冲液中裂解30min，用二氢二酸蛋白检测试剂盒提取细胞蛋白。离心后进行上清电泳。将样品转移到聚偏二氟乙烯膜密封1h。一抗为小鼠抗syt7、小鼠抗p53、小鼠抗p-p53和抗GAPDH抗体，4℃过夜。以山羊抗小鼠免疫球蛋白G偶联辣根过氧化物酶为二抗，1∶2000稀释，室温作用2h。增强化学发光和蛋白质印迹检测系统检测结合抗体。GAPDH为内参。

1.7""细胞周期分析

采用2ml–20°C预冷的70%乙醇收集细胞，重悬，在–20°C下固定过夜。离心后丢弃上清液，加入1ml预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate"buffered"saline，PBS）重悬细胞沉淀，37℃孵育30min。在细胞悬液中加入1∶20"1mg/ml的碘化丙啶储存液，在37℃黑暗中孵育30min。使用BD"FACSCalibur流式细胞仪（Becton，Dickinson"Bioscience）。FlowJo软件分析DNA倍性和细胞数量及细胞周期分布。

1.8""动物实验

将4周龄雄性SCID小鼠腹腔皮下注射与基质胶混合的3×106"U87细胞（shSYT7组和对照组）。将20只小鼠在恒湿（40%～70%）、恒温[（21±2）℃]条件下饲养，在特定的无菌设施中自由摄食和饮水。研究结束后2周用卡尺测量肿瘤大小。所有数据按公式v=0.5×a×b2（v为肿瘤体积；a为肿瘤长径；b为肿瘤宽径）计算体积。实验结束后处死小鼠或在肿瘤直径达到15mm时取肿瘤组织进一步检查。部分肿瘤组织石蜡包埋切片。

1.9""免疫组织化学

首先对肿瘤组织切片进行脱蜡处理，切片组织置于烤箱。对切片进行常规二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水：顺序为二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ15min，无水乙醇Ⅱ15min，95%乙醇15min，80%乙醇15min，蒸馏水中15min，1×PBS洗涤5min，3次。抗原修复：将切片置于0.01mol/L枸橼酸缓冲液（pH"6.0）中，煮沸（95℃，15～20min），待其自然冷却至室温，1×PBS洗涤5min，共3次。在组织切片上滴加10%山羊血清封闭液，37℃下孵育30min，倒去封闭液。滴加一抗：一抗稀释液对一抗稀释后滴加在切片上，4℃过夜，1×PBS洗涤5min，3次。在37℃下孵育30～60min，1×PBS洗涤5min，3次。组织切片上滴加Ⅲ抗（辣根酶标记链霉卵白素工作液），在37℃下孵育30min，1×PBS洗涤5min，3次。滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液（新鲜配制），遵循现用现配原则。以水冲洗组织切片，应用苏木精进行复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，使用中性树胶进行封片，37℃下干燥，显微镜观察并拍照。

1.10""统计学方法

采用SPSS"21.0统计学软件对数据进行处理分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用c2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2""结果

2.1""SYT7在U87细胞中表达情况及shSYT7在U87细胞中转染效率

通过RT-qPCR评估SYT7"mRNA的表达水平，见图1A。与正常脑细胞（HEB）比较，在U87细胞中SYT7"mRNA的表达水平显著升高。用shSYT7敲低SYT7，通过RT-qPCR评估SYT7"mRNA的表达水平，见图1B。与对照组比较，shSYT7可显著降低SYT7"mRNA的表达水平。

2.2""下调SYT7可抑制细胞增殖

细胞计数结果显示，与对照组比较，shSYT7对U87细胞生长有抑制作用（Plt;0.05），见图2。

2.3""SYT7敲低组U87细胞进程阻滞在G0/G1期

流式细胞术结果显示，与对照组比较，shSYT7将U87细胞周期阻滞在G0/G1期，见图3。

2.4""SYT7与Hedgehog/Gli信号通路密切相关

基因富集结果显示SYT7与胶质瘤的Hedgehog/"Gli信号通路密切相关，见图4，蛋白质印迹显示抑制SYT7可促进p53磷酸化，导致P53蛋白聚集，Gli1蛋白也受到抑制，见图5。

2.5""SYT7的下调抑制肿瘤生长

对SCID小鼠进行异种移植试验。在U87细胞系中，shSYT7在整个实验过程中均可减缓肿瘤的生长，SYT7敲低组小鼠的肿瘤大小明显小于对照组，见图6A；肿瘤体积明显小于对照组，见图6B；肿瘤质量明显小于对照组，见图6C。Ki-67免疫组化显示，对照组小鼠的Ki-67表达更高，见图6D。

3""讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，在中国的年发病率为（3～6）例/10万人[15]。目前，基于神经外科、放疗、肿瘤学的影像、病理相结合的多学科综合诊疗模式已应用于胶质瘤的治疗，但整体治疗效果较差，靶向生物治疗给患者带来新的希望。寻找新的治疗靶点，探索胶质瘤发生发展的分子机制具有十分重要的意义。生物靶向治疗的前提和关键是靶点选择。目前肿瘤血管生成、免疫检查点、癌基因等生物治疗靶点已取得很大进展，相应的靶向药物已用于临床治疗[16-25]。但大多数肿瘤具有异质性特征，导致同一药物靶点在不同类型的肿瘤或不同患者中存在较大差异。因此，探索肿瘤发病的分子机制是目前治疗胶质瘤的最佳途径。

本研究结果显示SYT7通过调节Hedgehog/Gli信号通路促进胶质母细胞瘤生长；检测SYT7在U87细胞系中的表达水平，但仅检测mRNA的表达，SYT7在肿瘤样本中的表达情况仍需进一步研究。蛋白质印迹和qPCR结果显示，shSYT7可有效抑制SYT7蛋白水平，并在U87MG细胞中发挥作用。细胞计数实验表明，shSYT7显著抑制U87MG细胞的增殖；流式细胞术检测显示，shSYT7使U87细胞周期停滞在G0/G1期。本研究发现SYT7通过调节Hedgehog/Gli信号通路促进胶质母细胞瘤的生长。SYT7的抑制可促进p53的磷酸化，导致P53蛋白积累，同时抑制Gli1蛋白的表达，这表明SYT7通过促进p53的磷酸化与Hedgehog/Gli信号通路相关。在SCID小鼠的异种移植实验中，shSYT7可显著减缓肿瘤的生长，SYT7敲低组小鼠的肿瘤大小、体积明显小于对照组，Ki-67免疫组化结果与前期实验一致，表明shSYT7可抑制异种移植物中U87细胞的增殖。以上结果表明下调SYT7在体内可抑制肿瘤的生长。然而，本研究结论仅基于单个细胞系，需要体外和体内实验进一步确定SYT7的生物学作用。

综上所述，SYT7通过调节Hedgehog/Gli信号通路促进胶质母细胞瘤的生长，SYT7可能是胶质母细胞瘤新的治疗靶点。SYT7在胶质母细胞瘤中的作用机制有待进一步研究。

利益冲突：作者声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–03–29）

（修回日期：2024–11–21）