基于13C-NMR 偶极去相技术的有机肥料中有机组分特征研究

摘要： 【目的】在固体13C-NMR 的交叉极化魔角旋转全边带抑制（cross polarization/magic angle spinning/totalsuppression of sidebands，CP/MAS/TOSS） 技术得到的谱图中，质子碳与非质子碳的信号重叠。偶极去相（dipolardephasing，DD） 技术利用13C-1H 异核耦合作用大小的差异，区分与不同质子结合的13C 核基团。本研究基于DD 技术探讨有机肥料中碳结构特征。【方法】供试有机肥料样品包括3 种秸秆（小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆）、3 种粪肥（鸡粪、牛粪、猪粪） 和3 种腐植酸肥（腐植酸铵、腐植酸钠、腐植酸钾） 样品，利用13C-NMR 谱的CP/MAS/TOSS 结合DD 技术，测定了不同来源的有机肥料样品图谱，比较其碳分布比例。【结果】秸秆和粪肥样品中烷氧碳组分较多，占鉴定出所有碳组分的比例分别为55% 和31%～37%，非质子化的烷氧碳占比不到3%；秸秆、猪粪样品中非质子芳香碳占3%～4%，鸡粪和牛粪样品中非质子芳香碳分别占15% 和11%，较秸秆和猪粪样品含有更多的非质子化芳香族化合物。粪肥和秸秆样品中甲氧基碳占比低于烷基氮。腐植酸样品以芳香碳、羧基碳和酰胺基碳为主，羧基碳和酰胺基碳占到12%～16%，总芳香族碳占48%～72%，非质子芳香碳占25%～37%，表明腐植酸芳香骨架上可能存在较多取代。【结论】基于CP/TOSS 结合DD 技术（偶极相移延时时间设置为40 μs） 分析结果发现，鸡粪和牛粪中非质子芳香碳占比高于猪粪和秸秆；腐植酸肥芳香族碳比例高于粪肥和秸秆，尤其是非质子芳香碳占比较高，表明腐植酸肥芳香化程度高于粪肥和秸秆。

关键词： 有机肥料； 13C-核磁共振； 交叉极化； 偶极去相

我国有机肥料资源丰富，每年养分总量约为7519.5 万t，原料主要来源于畜禽粪便、秸秆、腐植酸等[1]。表征有机肥料官能团组成与组分结构特征，有助于阐明有机肥料降解机理及有机肥料功能，对鉴定有机肥料原料来源，保障产品质量也具有重要意义。

核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR） 是根据外加磁场和射频脉冲作用下，特定原子的原子核能级跃迁产生的共振现象，探测物质内部结构和性质。根据谱图上共振峰位置、强度和精细结构研究样品的分子结构[2−3]。固体13C-核磁共振波谱技术（solid state 13C-NMR） 被广泛应用于土壤、沉积物等样品的有机质与腐殖质碳结构测定[4−10]。交叉极化/魔角旋转（cross polarization/magic angle spinning，CP/MAS） 技术克服固体样品化学位移各向异性、偶极偶合作用等[11]，提升了13C 核探测灵敏度和信号累积效率[12]。普通CP/MAS 脉冲序列高频率去偶时段加入4 个π13C 脉冲，利用边带全抑制（total suppressionof sidebands， TOSS） 谱线编辑技术，解决了固体样品NMR 分析时的旋转边带干扰问题[13]，但CP/TOSS 试验得到的谱图中仍然存在质子碳与非质子碳的信号重叠。

偶极去相（dipolar dephasing，DD） 技术利用13C-1H异核耦合作用大小的差异，区分与不同质子结合的13C 核基团。质子碳13C-1H 耦合作用较强，当去耦器关闭，横向驰豫时间T 2H 较短的质子化碳（ C H、CH2） 快速去相位，而横向驰豫时间T2H 较长的非质子碳如季碳（Cq）、非质子烷氧碳（OCq）、非质子芳香碳（aromatic C―C）、芳香碳氧（aromatic C―O）、酰基/羧基碳（N―C＝O/COO） 或快速活动性组分（mobile components） 如甲基碳（CH3 ）、甲氧基碳（OCH3）、亚甲基碳 [（CH2）n] 去相位较慢，在去偶器再次打开前得到保留[14]。Opella 等[15]提出了DD 的脉冲序列，在CP/MAS 基础上加入延时时间（TD），即在交叉极化和数据采集之间加入一个短暂TD， 1H 耦器先关闭再打开，在TD 期间，质子化碳受到偶极作用较强， 磁化强度即被驰豫，共振信号强度衰减，而非质子碳、快速活动性官能团的信号强度受影响甚微。为解决旋转边带和相位畸变问题，Carduner[16]提出了改进DD 脉冲序列，在TD 延时前添加4 个π 脉冲提高了分辨率。TD 延时时间影响质子碳去除效率与T2H 相关，只有TD 大于T2H 时才能有效去除质子碳信号。秦匡宗等[17]指出干酪根的13C-NMR 谱中质子碳T2H 在10～15 μs，非质子碳T2H 达200 μs。Alemany等[18]利用固体13C-NMR 技术研究了对二叔丁基苯等11 种有机物芳香族及环化物中13C-1H 偶极相互作用对CP 和DD 试验的影响，结果显示质子碳共振峰强度衰减75% 所需TD 分别为20～30 μs 和25～40 μs，非叔丁基CH3 和叔丁基CH3 共振峰强度衰减75% 所需的TD 分别为80～310 μs 和1300 μs，非质子的SP2和SP3 杂化碳共振峰强度衰减75% 所需的TD 分别在165 和1500 μs 以上。赵丕裕等[19]分析不同延时条件下羟基苯甲酸乙酯样品中各类碳的信号衰减规律，结果表明，DD 技术可以较有效地抑制质子化碳（甲基碳除外） 的共振信号，信号在TD 40 μs 时衰减为零。TD 40 μs 也应用土壤、沉积物等样品的DD 试验[20−22]，可从固体样品CP/MAS/TOSS-NMR 谱图中有效区分CH 和CH2 碳信号。

Liitiä等[23]利用CP+DD 技术研究土壤中木质素的缩合程度。Mao 等[24]将DD 技术结合直接极化魔角旋转、化学位移各向异性过滤等技术，获得了泥炭腐植酸固体13C-NMR 图谱，结果显示泥炭腐植酸中芳香碳比例为45%，非质子芳香碳占芳香碳的0.64%。Smernik 等[ 2 5 ]利用CP+DD 技术测定了土壤中纤维素、半纤维素、木质素、几丁质、蛋白等组分特征，通过不同TD 时间与共振峰峰面积的关系计算组分中质子碳和非质子碳的T2H，结果显示，非质子碳的T2H 不低于167 μs，非甲基化质子碳的T2H 不高于17.26 μs，大多数质子碳核磁信号在TD 40 μs 时消失。Mao 等[26]综述了天然有机物的固体NMR 技术，当旋转频率lt;10 kHz，40 μs 的TD 时间可去除大部分天然有机物中质子碳。Huang 等[10]设置40 μs 的TD 时间，利用NMR 技术研究了堆肥70 天的猪粪、鸡粪、牛粪中有机碳结构变化。Almendros 等[27]采用DD 技术揭示了森林火灾后土壤中含碳有机物的分布。利用DD 技术研究不同原料来源的有机肥料组分特征少见报道。本研究利用1 3C-NMR 谱的CP/MAS/TOSS 结合DD 技术，测定了秸秆、粪肥、腐植酸等9 个不同来源的有机肥料样品图谱，比较其碳分布比例，以期深入阐明不同有机组分的精细结构特征。

1 材料与方法

1.1 供试有机肥料样品

选择9 个有机肥料样品：小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、鸡粪、牛粪、猪粪、腐植酸铵、腐植酸钠、腐植酸钾。 样品碳氮含量见表1。样品用研磨仪研磨粉碎过0.15 mm 筛后烘干，装入样品袋中备用。

1.2 试验步骤

称取100 mg 左右试样，填充装入氧化锆转子中，将转子放入CP-MAS 4 mm 探头。固体核磁共振波谱仪（型号：Bruker Advance III 400， Bruker BioSpinGmbH， Rheinstetten， Germany） 设置测定参数为：13C 频率为100 MHz，MAS 旋转转速为5 kHz，TD为0.8 s ，CP 接触时间（contact time） 为2 ms，1H 90°脉宽3.75 μs。TOSS 技术的4 个180°脉宽8.4 μs。扫描次数为4096 次。使用甘氨酸（glycine） 和金刚烷（adamantane） 标定化学位移。DD 试验采用Carduner[16]提出的改进偶极去相脉冲序列（图1）。

设置TD 延时20、40、60、80 μs 条件，测定秸秆CP/TOSS 和DD 谱图见图2。在TD 延时40 μs时，化学位移范围在60～93 ppm 的烷氧碳（O-alkylC） 和93～113 ppm 的异头碳（anomeric C） 的共振峰信号被显著抑制，而在174 ppm 处的非质子官能团羧基/酰胺基（COOH/N―C＝O） 的信号保留。图谱在40、60 和 80 μs 的TD 延时条件下共振峰未见明显变化。TD 延时为40 μs 条件，DD 试验可筛选出秸秆样品中的非质子碳及快速活性移动组分。

1.3 数据分析

核磁共振图谱使用Bruker Topspin 2.1 和Mestrec（Bruker BioSpin GmbH， Rheinstetten， Germany） 调整零级、一级相位，校正基线，平滑处理，对图谱进行积分，获得不同碳核官能团占谱图总积分面积的相对比例，根据文献[10， 26]，图谱中含碳官能团与化学位移δ 对应：烷基碳（alkyl C） 0～44 ppm；甲氧基碳/烷基氮（methoxyl C/N-alkyl） 44～60 ppm；烷氧碳（O-alkyl C） 60～93 ppm；异头碳（anomeric C） 93～113 ppm；芳香碳（aromatic C） 113～142 ppm；芳香碳氧（aromatic C―O） 142～162 ppm；羧基/酰胺基碳（carbonyl/amides C） 162～188 ppm；酮/醛基碳（ketone/aldehyde C） 188～220 ppm。由于去耦器关闭导致质子碳、非质子碳均产生信号衰减，将174 ppm处非质子官能团羧基/酰胺基（COOH/N―C＝O） 的共振峰作为校正因子校正偶极去相期间的信号损失。CP/MAS/TOSS 图谱与DD 图谱差减得到质子化碳组分。

2 结果与分析

2.1 CP/MAS/TOSS 谱图解析

有机肥料的CP/MAS/TOSS 谱图见图3，各类碳官能团所占相对比例见表2。秸秆样品在0～188 ppm范围内存在共振峰，以烷氧碳、异头碳、烷基碳官能团为主。烷氧碳（60～93 ppm） 占比55% 左右，归属为碳水化合物如醇类、纤维素、半纤维素糖苷特征。异头碳（93～113 ppm） 占比约14% 左右，系纤维素半纤维素中的β-1，4 糖苷键中的C1、C4 特征。烷基碳（0～44 ppm） 占比在7%～11%，该区域存在双峰，21 ppm 共振峰由CH3 及少量CH2 引起，30 ppm 共振峰由CH2 引起。甲氧基碳/烷基氮（44～60 ppm） 占比6%，归属为木质素中甲氧基特征或氮取代的烷基碳。羧基/酰胺基碳（162～188） 占比5%～7%。芳香碳（113～142 ppm） 占比5%～6% 左右，共振峰集中在128、134 ppm 附近，为木质素中芳香碳C―H 或C―N、C―C。芳香碳氧（142～162 ppm） 占比3%～5%，为木质素特征，由木质素结构单元香豆醇、松柏醇或芥子醇中被氧取代的酚基引起。酮基碳、醛基碳及醌基区域（188～220 ppm）信号与基线持平。

鸡粪、牛粪和猪粪图谱在0～220 ppm 范围内存在共振峰。3 个粪肥样品烷氧碳占比31%～37%。鸡粪和牛粪中芳香碳占比分别为18% 和11%，归属木质素特征，鸡粪样品共振峰在127、148 ppm，牛粪共振峰在133、152 ppm；猪粪芳香碳占比5%，共振峰在130 和148 ppm。烷基碳在鸡粪和牛粪中贡献占比分别为12% 和11%，猪粪为28%，牛粪在18 ppm处有明显单峰，鸡粪、猪粪在14、23、32 ppm 处为多重峰，0～25 ppm 由CH3 和少量CH2 引起，25～44 ppm 由长链CH2 引起。甲氧基碳/烷基氮位移在57 ppm，鸡粪、牛粪、猪粪中占比分别为8%、15%、6%，为木质素中OCH3 结构或氨基酸蛋白质成分。异头碳在3 个粪肥中占比为10%～12%，位移集中在105 ppm。羧基/酰胺基碳位移集中在173 ppm，鸡粪、牛粪、猪粪中占比分别为10%、7%、11%。粪肥样品中酮/醛基碳占比不超过1%。

腐植酸铵和腐植酸钠谱图相近，主要在60～188 ppm 范围内存在共振峰，腐植酸钾在0～60 ppm范围内还存在共振峰。3 个腐殖酸样品有机碳归属以芳香碳为主，腐植酸铵、腐植酸钠和腐植酸钾芳香碳占比分别为72%、67%、48%，共振峰在130 和156 ppm 附近，为木质素来源的芳香碳和芳香碳氧特征。异头碳在腐植酸铵、腐植酸钠、腐植酸钾占比分别为6%、12%、6%，共振峰不明显，与芳香区域重叠。腐植酸铵、腐植酸钠、腐植酸钾样品中羧基/酰胺基碳（176 ppm） 占比分别为16%、12%、16%。腐植酸钾中烷基碳占比为14%，共振峰在21 和30 ppm，甲氧基碳/烷基氮 （49 ppm） 占比6%。3 个腐植酸在酮/醛基碳区域信号与基线持平。

2.2 DD 谱图解析

DD 谱图（图3） 可筛选出有机肥料中的非质子碳和快速活动性组分，相比CP 谱图，0～142 ppm 位移范围内信号出现明显衰减，而142 ～220 ppm 范围内的信号损失较少，与CP 图谱相近，表明该化学位移范围内的多是非质子碳，C―H 耦合作用较弱，40 μs 的去耦时间不足使其失相。将CP 和DD 谱图由校正因子校正后差减，得到去质子碳等相应官能团的比例 （表2）。

秸秆样品中，烷基碳（Cq） 和快速活动性组分占比3%～5%，OCH3 占比1%～2%；烷氧碳中非质子OCq 和非质子异头碳O―Cq―O 占比很少，不超过1%；非质子芳香碳占比3%～4%。说明秸秆样品主要以纤维素来源的质子碳OCH、O―CH―O 基团为主。秸秆样品中NCH 略高于木质素来源的OCH3。存在超过一半芳香碳为非质子芳香碳，说明芳环上存在较多取代基。

3 种粪肥样品烷基碳（Cq） 和快速活动性组分占比7%～12%；鸡粪非质子烷氧碳OCq 占比3%，牛粪与猪粪无OCq 信号；粪肥样品非质子异头碳O―Cq―O 占比不到2%。鸡粪、牛粪与猪粪OCH3 占比分别为3%、6% 和1%；非质子芳香碳占比15%、11%和3%。粪肥样品烷基碳和快速活动性组分、非质子芳香碳占比明显高于秸秆样品。鸡粪、牛粪芳香碳中非质子化比例分别为15% 和11%，高于猪粪（3%），猪粪与秸秆样品类似。

腐植酸样品中，非质子烷氧碳OCq 占比2%～5%，异头碳O―Cq―O 占比2%～8%。矿源腐植酸钾中NCH 和 OCH3 分别占比5% 和1%，质子化烷基碳和非质子烷基碳占比分别为9% 和5%。腐植酸样品主要以芳香族化合物为主，非质子芳香碳占比25%～37%，明显高于粪肥与秸秆样品，说明芳香碳存在较多的取代基团。

3 讨论

DD 技术通过有机物中13C―1H 耦合作用强弱来区分质子碳与非质子碳、刚性组分和快速活动性组分，与1H 直接相接的质子碳相比于非质子碳有较短的横向弛豫时间，因此在一定TD 时间内，质子碳快速失相，例如脂肪长链的CH2、芳香族的CH，而非质子碳如Cq、O―Cq、芳香碳等以及快速活动性组分信号保留下来，这是由于甲基快速旋转减少了13C―1H 偶极耦联[26]。因此DD 图谱相比于CP 图谱可获得更多的有机碳官能团结构信息。

农作物秸秆化学成分以纤维素、半纤维素、木质素为主。Bhattacharyya 等[28]测定了印度东部18 个不同品种水稻秸秆化学组成，发现纤维素、半纤维素、木质素、二氧化硅平均占比分别为36.29%、20.67%、9.42%、6.67%。Cogle 等[29]利用13C 固体NMR 技术测定了小麦秸秆的CP/TOSS 图谱，小麦秸秆碳官能团归属位移多在60～108 ppm 范围，以碳水化合物为主，占比为72%，其次是108～160 ppm（芳香碳） 和0～50 ppm （烷基碳），占比为9%。Xiao等[30]提取了玉米、黑麦、水稻秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素，并获得13C-NMR 图谱，结果显示3种农作物秸秆中木质素为非缩合愈创木基和紫丁香基单元，而对羟基苯基单元较少。玉米和黑麦秸秆的半纤维素以葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖为主，而水稻秸秆中半纤维素主要是α-葡聚糖和4-0-甲基-D-葡萄糖醛酸。本研究3 个秸秆的13C-NMR 图谱，显示以纤维素来源的烷氧碳为主，纤维素是由D-葡萄糖以β-1，4 糖苷键组成的大分子多糖，糖环上的碳基本为质子碳，DD 技术可明显区分开。由于禾本科植物木质素的芳香结构以愈创木基−紫丁香基为主，存在OCH3、酚基取代，DD 技术的TD 延时后，少部分的芳香碳氢信号损失。秸秆样品表皮上角质和软木脂存在大量的含快速活动性组分的脂肪长链，在偶极去相后信号消失。烷氧碳占比55% 左右，归属为碳水化合物如醇类、纤维素、半纤维素糖苷特征。异头碳占比约14% 左右，系纤维素半纤维素中的β-1，4糖苷键中的C1、C4 特征。烷基碳占比在7%～11%，该区域存在双峰。

畜禽粪便是畜禽粪尿与垫材、动物毛发皮屑、饲料残渣和水等混合物[2]。Luo 等[31]通过固体13C-NMR技术测定了鸡粪中的总有机质、碱提取有机质、水提有机质，DD 图谱显示烷氧碳和异头碳共振峰信号被显著抑制，部分烷基碳和芳香碳共振峰信号保留，这与我们的研究结果相符。Schnitzer 等[32]利用固体13C-NMR 测定了新鲜鸡粪的CP 图谱，鸡粪中总脂肪碳含量占比87.2%，总芳香物质占比6.3%。本试验收集的粪肥样品中鸡粪、牛粪经过发酵堆肥腐熟过程[33]，脂肪族碳尤其烷氧碳占比较秸秆少，芳香碳含量增加，非质子芳香碳占比也较秸秆样品高，说明样品中碳明显趋向稳定。本次试验采集的猪粪样品，可能未经过长时间的发酵堆肥腐熟，与鸡粪牛粪相比，猪粪样品含有较高比例的质子化烷基碳，芳香碳尤其是非质子的芳香碳组分比例相对较低。

腐植酸类物质是高分子聚合物，结构复杂，普遍认为其是多元酚和醌作为结构单元的聚合物[34]。根据Schulten 等[35]提出腐植酸经典模型，芳香酸和甲基化酚是腐植酸的主要官能团。腐植酸具备脂肪−芳香族基本结构单元及多种官能团如羧基、羰基、醌基、酚羟基、醇羟基、胺基等[36]。本研究选择的3 个腐植酸样品，以芳香物质和羧基酰胺基为主，在TD延时后芳香环碳氢信号仅损失了一小部分，这可能是由于腐植酸具备芳香环及周围侧链，存在羧基、酰胺基或杂原子取代基，与Mao 等[24] 和阳虹等[37]的研究结果相符。3 个腐植酸中存在12%～16% 芳香碳氧，表明了其具备大量的酚类结构。与腐植酸钾相比，腐植酸铵和腐植酸钠拥有较多的脂肪碳，且脂肪碳以质子碳CH、CH2 为主，推测其芳香环上存在脂肪长链。

4 结论

研究结果显示在偶极相移TD 时间40 μs 下，利用DD 图谱可筛选出有机肥料中非质子碳和快速活动性组分。秸秆和粪肥样品以纤维素来源的烷氧碳为主，秸秆中烷氧碳占比55%，粪肥中占比31%～37%，非质子的烷氧碳含量均不超过3%。鸡粪、牛粪较秸秆样品存在更多的非质子脂肪族化合物和芳香化合物，粪肥和秸秆中甲氧基碳占比低于烷基氮。芳香碳、羧基碳和酰胺基碳在腐植酸样品中含量最高，芳香族碳占比48%～72%，羧基酰胺碳占比不低于12%，腐植酸钾相比于腐植酸铵和腐植酸钠含有较多的脂肪碳，样品芳香物质上存在较多的取代基，非质子芳香碳组分占总芳香碳比例50% 左右。利用CP/MAS/TOSS+DD 技术更加精细地研究有机肥料组分结构特征，可获取有机肥料的质子碳和非质子碳官能团信息。

参 考 文 献：

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基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFD1700603，2018YFD0201203）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（Y2019PT20-04，1610132019018）。