基于枢机理论探讨电针对PCPA致失眠大鼠MFG-E8的影响

摘要：目的 探讨电针对对氯苯丙氨酸（4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA）致失眠大鼠乳脂球表皮生长因子 VIII（Milk fat globule-epidermal growth factor VIII，MFG-E8）的影响。方法 50只SD大鼠（雌雄各半）随机抽取10只作为空白组，除空白组外，剩余40只均腹腔注射PCPA建立失眠模型，经造模、筛选随机分为模型组、电针组、艾司唑仑组，每组10只，观察大鼠一般情况变化，戊巴比妥钠睡眠试验观察大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间，经电针、艾司唑仑药物干预7d后，酶联免疫法（ELISA）检测大鼠血清中MFG-E8含量，Western blot法检测下丘脑组织中MFG-E8蛋白表达。结果 经PCPA造模干预的失眠模型大鼠，戊巴比妥钠睡眠实验显示，睡眠潜伏期延长（P<0.01），睡眠持续时间缩短（P<0.05）；与空白组比，模型组大鼠血清MFG-E8水平降低（P<0.05），下丘脑中MFG-E8蛋白相对表达量下降（P<0.01）；经电针、艾司唑仑药物干预后，失眠大鼠昼夜节律明显改善，体质量明显升高（P<0.05），血清中MFG-E8水平升高（P<0.01）；下丘脑中MFG-E8蛋白相对表达增高（P<0.01）；电针组与艾司唑仑组之间MFG-E8含量无明显统计学差异（P>0.05）。结论 电针对PCPA致失眠大鼠睡眠障碍具有改善作用，揭示电针可上调MFG-E8的表达，其可能机制与MFG-E8调控小胶质细胞，逆转M1表型极化，降低致炎因子水平有关。

关键词：失眠；炎症；电针；MFG-E8；小胶质细胞

中图分类号：R246 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2024）11-0069-06

Exploration of the Effect of Electroacupuncture on MFG-E8 in PCPA-Induced Insomnia Rats Based on the Pivot Theory

TAN Tian1， ZHANG Meng1， WU Yuan1， LIU Lian2， SHI Xue-hui2

（1. The Second Clinical College of Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of electroacupuncture on milk fat globule-epidermal growth factor VIII（MFG-E8） in rats with insomnia induced by 4-chloro-DL-phenylalanine（PCPA）. Methods： Fifty SD rats（equally divided by gender） were randomly selected， with 10 rats serving as the blank group. The remaining 40 rats were administered PCPA via intraperitoneal injection to establish an insomnia model. After modeling， the rats were randomly divided into the model group， electroacupuncture group， and estazolam group， 10 rats each group. The general conditions of the rats were observed， and the pentobarbital sodium sleep test was used to measure sleep latency and sleep duration. After 7 days of intervention with electroacupuncture or estazolam， MFG-E8 levels in the serum of the rats were measured by using ELISA， and the relative expression of MFG-E8 protein in the hypothalamus was detected by Western blot. Results： In the PCPA-induced insomnia model rats， the pentobarbital sodium sleep test showed prolonged sleep latency（P<0.01） and shortened sleep duration（P<0.05）. Compared with that of the blank group， the serum MFG-E8 levels in the model group were reduced（P<0.05）， and the relative expression of MFG-E8 protein in the hypothalamus decreased（P<0.01）. After intervention with electroacupuncture and estazolam， the circadian rhythm of insomnia rats significantly improved， and body weight increased（P<0.05）. MFG-E8 levels in the serum increased（P<0.01）， and the relative expression of MFG-E8 protein in the hypothalamus also increased（P<0.01）. No significant statistical difference in MFG-E8 levels was observed between the electroacupuncture and estazolam groups（P>0.05）. Conclusion： Electroacupuncture improves sleep disorders in PCPA-induced insomnia rats， suggesting that electroacupuncture may upregulate the expression of MFG-E8. The underlying mechanism might be related to MFG-E8s regulation of microglial cells， reversal of M1 phenotype polarization and reduction of pro-inflammatory cytokine levels.

【Key words】Insomnia; Inflammation; Electroacupuncture; MFG-E8; Microglial Cells

失眠以睡眠难以启动或难以维持为主要特点，并伴有焦虑易怒、疲劳、记忆障碍等症状^［1］，严重影响人们的生活质量，长期睡眠不足会造成体内慢性炎症，增加心肌损伤、动脉粥样硬化、患糖尿病、阿尔茨海默病等疾病的风险^［2-3］，对神经免疫系统、心血管系统、精神等多个方面的健康造成威胁。目前失眠的发病机制迄今尚未完全阐明。慢性炎症、神经递质异常改变与失眠、抑郁、阿尔兹海默症和帕金森病等多种神经系统疾病密切相关^［4-5］，影响神经-内分泌-免疫系统调节。小胶质细胞过度活化后诱导的神经炎症可导致突触变性、神经细胞死亡和认知功能障碍^［6］。基于小胶质细胞角度，其介导的炎症与失眠的发生发展联系密切，小胶质细胞两种表型M1、M2在机体受到刺激时分泌炎症因子，发挥着致炎与抗炎的作用共同调节机体内环境，失去平衡时，持续神经炎症进展进而诱发失眠，当机体处于失眠状态时又会加速致炎因子的释放。同时，课题组前期研究发现PCPA致失眠大鼠小胶质细胞明显活化，血清及下丘脑的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表达明显增加，结合现有研究提示，失眠使得机体内促炎与抗炎的平衡被打破，再次验证失眠与小胶质细胞介导的炎症息息相关。

乳脂球表皮生长因子 VIII（MFG-E8）是一种分泌性糖蛋白，具有广泛的细胞功能，包括吞噬凋亡细胞、抗炎、组织再生和体内平衡。它可以由多种细胞类型如小胶质细胞、巨噬细胞、星形胶质细胞和神经干细胞等分泌，在预防神经元性疾病中起着关键作用^［7-9］；有研究显示，MFG-E8可通过各种途径如上调 PI3K-Akt 通路（抑制炎症损伤起保护作用）^［10］并下调 NF-KB 信号通路（炎症反应的重要参与者）^［11］，逆转小胶质细胞 M1表型极化，以及提升小胶质细胞的吞噬速率等，调节小胶质细胞的功能、调控炎症因子水平。神经炎症在失眠的发生发展中扮演着重要角色，通过MFG-E8干预小胶质细胞功能从而减少神经炎症可成为治疗失眠有前景的策略。

针灸作为一种非药物治疗手段，其不良反应少，疗效可靠，不存在药物依赖和戒断反应。已有研究证实，针刺治疗能够显著改善失眠患者入睡困难、易醒、焦虑、抑郁症状^［12］。同时证实电针可通过调节相关炎症信号通路，如NF-KB信号通路等调控炎症因子水平来减轻神经炎症改善睡眠^［13］。失眠属中医之“不寐”，关键病机在于“阴阳失交”，阴阳的出入运动又与三阴三阳开阖枢密切相关。基于枢机理论，调节少阳、少阴之枢机是解决阴阳失交的关键之法。再者，名医临证经验证实^［14］以调枢安神为切入点，以少阴、少阳经穴及督脉腧穴为主，选取神门、三阴交、百会、本神四穴临床上治疗失眠及改善其伴随症状疗效显著。

本研究采用对氯苯丙氨酸（PCPA）建立失眠大鼠模型，选用电针刺激神门、三阴交、百会、本神穴位，观察大鼠一般行为学变化和血清、下丘脑的MFG-E8表达，探究电针对失眠模型大鼠MFG-E8的影响，探索MFG-E8与小胶质细胞炎症之间的联系，现报道如下：

1 材料

1.1 实验动物 购入SPF级健康大鼠50只（雌雄各半），体质量（170±10）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SYXK（湘）2019-0009。本实验通过湖南中医药大学动物研究伦理委员会批准，批准编号：LLBH-202211080001。

1.2 实验药物 对氯苯丙氨酸（PCPA）（HY-B1368 美国MCE公司）、戊巴比妥钠（P3761 美国西格玛奥德里奇公司）、艾司唑仑片（规格1mg/粒，华中药业）。

1.3 主要实验试剂与仪器 阿拉伯胶水溶液、NaHCO3溶液、水合氯醛溶液均购于北京雷根生物技术有限公司（批号分别为IH0262、CC0141、R00635）、PH精密试纸（H821220上海麦克林生化科技有限公司）、超声机（F-010S 深圳福洋科技有限公司）、针灸针（0.25×25MM 苏州针灸用品有限公司）、电子针疗仪（SDZ-V型 苏州医疗用品厂有限公司），乳脂球表皮生长因子-8（milk fat globule-epidermal growth factor-8，MFG-E8）酶联免疫吸附测定（Elisa）试剂盒，购于江苏菲亚生物科技有限公司（批号：2401R28）。

2 方法

2.1 动物分组及造模方法 选取50只大鼠于湖南中医药大学实验动物中心实验室内动物房饲养，温度24℃～26℃，湿度40%～60%，配有独立通风系统。动物运抵饲养房后，适应性喂养 7d后随机分为空白组（10只）和模型组（40只），筛选出造模成功后的30只大鼠与空白组10只进行实验，本研究最终采用实验大鼠共40只，分为空白组、模型组、电针组、艾司唑仑组4组。造模方法^［15］：模型组大鼠每天上午8点腹腔注射PCPA（500 mg/kg·d，1 mL/100 g）混悬液，以制备失眠模型，每日1次，连续2 d。造模成功的大鼠表现为昼夜节律消失、白天活动增多、对声响异常敏感、躁动、攻击性及兴奋性增加等行为^［16］，同时予以戊巴比妥钠睡眠试验再次验证。

2.2 动物行为学观察 观察大鼠一般情况变化，包括昼夜节律、体质量变化、精神状况、活动性、皮毛情况等。

2.3 戊巴比妥钠睡眠试验^［17］ 第1次腹腔注射 36h 后，正常组和造模组大鼠均腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg，1%浓度），当大鼠刚入睡时，将大鼠放垫块上，腹部朝上，定义翻正反射消失持续1min为进入睡眠，翻正反射恢复为觉醒，记录每只大鼠从给药开始到翻正反射消失的时长作为睡眠潜伏期，从翻正反射消失到恢复的时间为睡眠持续时间，比较正常组和造模组在以上两个指标的差异。

2.4 干预方法及取材 造模成功后称重，第2 d开始干预，电针组刺激大鼠的神门、三阴交、百会、本神穴位，20 min/次；其中，百会、本神穴平刺，神门、三阴交直刺，针刺得气后，电针仪连接同侧神门、三阴交，共 2组，选用连续波、频率为2Hz，电流强度以局部皮肤肌肉轻微颤动为度；艾司唑仑组（0.2 mg/kg）溶液灌胃，所有治疗均1次/d，持续7d。模型组制备模型成功后正常喂养至取材，空白组不做治疗。所有治疗结束后，将大鼠称重后麻醉，取腹主动脉血，室温自然凝固10-20 min，3000 r/min离心10 min，收集上清液；取完腹主动脉血之后，断头取脑，参照大鼠大脑立体定位图，剥离下丘脑结构，在生理盐水中轻轻漂洗后，置于无菌冻存管中，血清和脑组织保存于-80°C冰箱。

2.5 酶联免疫法检测血清中MFG-E8 采用ELISA法测定血清中MFG-E8含量，取腹主动脉血上清液于EP管中，严格遵照试剂盒操作指南，在酶标仪上读取450nm波长吸光度值并记录。

2.6 Western blot法检测下丘脑组织中MFG-E8蛋白表达 取下丘脑组织，冰上研磨，加入细胞裂解液，超声组织破碎仪提取蛋白，10 min 后，12000r/min 离心 15min，取上清液，采用 Western blot 技术检测MFG-E8表达情况。

2.7 统计学方法 采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9软件分析处理数据及作图，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计处理，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况变化 空白组大鼠表现为正常昼夜活动模式，精神良好，毛发白皙且有光泽；与空白组对比，失眠模型组出现白天活动变多，易激惹，毛发发黄失去光泽，兴奋性及攻击性增强，同时体质量显著降低；与失眠模型组比较，电针组和艾司唑仑组大鼠上述情况均得到不同程度改善，见表1。

造模前后，与空白组比较，其余各组大鼠体质量均不同程度下降（P<0.05），造模组间大鼠体质量变化差异无统计学意义（P>0.05）；治疗前后比较，各组大鼠体质量均有增长，与空白组比较，失眠模型组大鼠体质量增长较缓（P<0.05），与失眠模型组比较，电针组大鼠体质量明显增长（P<0.05），艾司唑仑组大鼠体质量有所增长，但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

3.2 造模期各组大鼠睡眠实验 戊巴比妥钠睡眠实验：与空白组对比，模型组大鼠睡眠潜伏期延长（P<0.01），睡眠持续时间缩短（P<0.05），见表3。结合大鼠一般情况及体质量变化，进一步验证失眠模型造模成功。

3.3 电针对失眠大鼠血清MFG-E8的影响 与空白组对比，模型组大鼠血清MFG-E8水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，电针、艾司唑仑组大鼠血清中MFG-E8水平升高（P<0.01）；与电针组比较，艾司唑仑组大鼠血清中MFG-E8水平差异无统计学意义（P>0.05），见表4、图1。

3.4 电针对失眠大鼠下丘脑组织MFG-E8的影响 Western blot检测结果显示，与空白组比较，失眠模型组大鼠下丘脑中MFG-E8蛋白相对表达量显著下降（P<0.01）；与失眠模型组大鼠比较，电针组与艾司唑仑组大鼠下丘脑中MFG-E8蛋白相对表达量均增高（P<0.01）；电针组与艾司唑仑组之间差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

4 讨论

失眠属中医之“不寐”，关键病机在于“阴阳失交”，针灸治疗失眠疗效显著且安全性较高。《素问·阴阳离合论篇》中提到：“太阳为开，阳明为阖，少阳为枢”，“太阴为开，厥阴为阖，少阴为枢”^［18］，“枢”包含阴阳两个方面，少阳枢机为阳枢，少阴枢机为阴枢，枢机功能失常，人体阴阳失和则出现失眠。基于此，枢转阴阳之气、调枢安神是治疗失眠的关键，在临床实践上，名医经验^［14］及导师临证经验应用神门、三阴交、百会、本神等治疗失眠疗效显著。在文献报道中显示，电针治疗百会、神门、三阴交等穴可调节失眠患者炎症因子及睡眠因子^［19-20］，能够明显改善失眠患者入睡困难、易醒、焦虑、抑郁等伴随症状。

本次实验显示，空白组大鼠表现为正常昼夜活动模式，精神良好，毛发白皙且有光泽；失眠模型组出现白天活动变多，易激惹，毛发发黄失去光泽，兴奋性及攻击性增强，同时体质量显著下降；戊巴比妥钠睡眠实验显示，失眠模型组大鼠睡眠潜伏期延长，睡眠持续时间缩短，提示实验大鼠经PCPA造模成功，出现明显睡眠障碍。经电针及药物干预后，大鼠的一般状况明显改善，体重稳步增长，躁动减少，睡眠障碍得到明显改善，表示以调枢安神为切入点，选取神门、三阴交、百会、本神进行电针刺激可明显改善失眠。

失眠的病因复杂，其发病机制多涉及神经-内分泌-免疫系统。近年来越来越多研究者将睡眠与觉醒机制的研究放在小胶质细胞上，小胶质细胞作为中枢神经系统内固有免疫细胞，可参与免疫调节和信号转导等来影响包括睡眠在内的生理结果和病理状态。Wadhwa等^［21］研究发现48 h 的睡眠剥夺小鼠海马内小胶质细胞特异性表达Iba-1增多，TNF-α、IL-6 和 IL-1β等炎症因子的浓度显著升高。白细胞介素（IL）和TNF-α的水平变化在睡眠调节中起重要作用^［22］；临床研究显示在失眠患者体内通常可检测到水平明显升高的炎性反应因子^［23］，随着炎症因子的堆积，非快速眼动（NREM）和快速眼动期（REM）睡眠均减少，可进一步导致失眠发生。由此可见，失眠的发生发展与小胶质细胞炎症密切相关。同时，有研究显示^［24］，艾司唑仑属苯二氮·类药物的一种，可参与到与氧化应激、神经炎症相关的神经退行性疾病中。罗佳佳^［25］在应用加味酸枣仁汤对阿尔茨海默病大鼠学习记忆的影响及机制研究中，选取艾司唑仑作为西药对照组，结果显示艾司唑仑组同样对大鼠脑区及血清中炎症因子如IL-1β、TNF-α有下调作用。课题组前期研究同样发现经电针与艾司唑仑药物干预后的失眠模型大鼠，炎症因子IL-6、TNF-α水平均有不同程度下降，实验选用艾司唑仑作为药物对照，揭示电针同艾司唑仑药物比，两者均对失眠具有明显改善效应，其作用机制涉及神经-内分泌-免疫系统，由此可用来探究中枢神经系统小胶质细胞功能与炎性因子之间的关系。

根据分泌的细胞炎症因子的不同，活化的小胶质细胞分为M1型和 M2型，M1型主要分泌一系列促炎因子，包括TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮合酶（iNOS）等，诱导白细胞迁移，推进炎症进程；M2型主要分泌抗炎因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、精氨酸酶1（Arg1）和IL-10等，发挥促进神经再生修复、吞噬坏死组织碎片的重要作用^［26］。文献报道，慢性睡眠剥夺会使小胶质细胞过度激活^［27］。课题组前期研究发现，在PCPA致失眠大鼠体内，小胶质细胞明显活化，致炎因子IL-6、TNF-α表达显著升高；结合本次研究显示，失眠模型大鼠MFG-E8水平及蛋白相对表达量下降，提示处于失眠状态的机体内保护性因子受到影响而减少，失眠大鼠体内致炎因子水平升高，激活的小胶质细胞以M1表型为主，小胶质细胞吞噬功能及机体抗炎症能力下降。

MFG-E8具有多种生物学功能，可刺激巨噬细胞增强吞噬功能、有效清除凋亡细胞及碎片、避免毒性物质积累从而维持内环境稳态、对小胶质细胞功能进行调节等；有研究^［28］发现将重组 MFG-E8（rmMFG-E8）注入被氧糖剥夺后的小胶质细胞后，可逆转细胞凋亡从而促进小胶质细胞向M2极化，起到抗炎作用并促进组织修复。同时，MFG-E8 作为调节小胶质细胞的重要信号分子，在调控小胶质细胞的吞噬功能中发挥重要作用，MFG-E8表达增强可显著提升其吞噬速率^［29］。对于一些会持续激活小胶质细胞的中枢神经系统疾病，MFG-E8 可以平衡小胶质细胞极化过程，调节炎症反应^［30］。本次研究显示，与失眠模型组大鼠比较，电针组与艾司唑仑组大鼠血清及下丘脑区域中MFG-E8水平显著升高，提示电针与艾司唑仑药物可增加Mfk1dK9E74nwDI6jNgL470A==FG-E8水平，影响小胶质细胞功能从而降低炎症水平，一方面验证了小胶质细胞炎症与失眠的紧密联系，另一方面，这也是电针治疗失眠的干预机制之一，通过调控小胶质细胞功能，逆转小胶质细胞M1表型极化，减少致炎因子的释放，从而减轻神经炎症以改善失眠。邵敬芝等^［31］在体外实验研究发现TNF-α和白细胞介素（IL）在小胶质细胞中的表达随着 MFG-E8 的增加或减少而减少或增加，其整体结果趋势与本次实验大致一致。

综上所述，电针对PCPA致失眠大鼠睡眠障碍具有改善作用，可上调MFG-E8表达，其可能机制与调控小胶质细胞极化功能，逆转M1型极化相关，降低致炎因子水平，减轻神经炎症，为针灸治疗失眠寻找治疗靶点提供了科学的实验依据。但电针影响MFG-E8调控小胶质细胞极化及炎症因子的具体通路尚未阐明，MFG-E8的更多生物学功能有待探aROLfHzteEQ3x3j57C2HIw==索，未来研究可利用MFG-E8 对小胶质细胞的调节作用，挖掘其在神经保护等方面的潜力，探寻MFG-E8 成为治疗更多疾病的新靶点。

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（收稿日期：2024-06-26）