LC-MS/MS法对血栓通注射液中皂苷成分快速定量分析

【摘要】目的：建立LC-MS/MS方法快速测定血栓通注射液中5种皂苷成分。方法：色谱柱为BEH C18（2.1mm*100mm，1.8μm），流速为0.400mL/min，流动相为乙腈-水，洗脱方式为梯度洗脱，柱温为30℃，进样量为2μL；采用多重反应监测模式（MRM）下负离子扫描方式，离子源为ESI-。结果：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd及三七皂苷R1在浓度范围内线性关系良好，R2>0.999，定量限在0.34～1.45ng/mL；低、中、高3种浓度水平加样回收率在90.59%～104.10%，相对标准偏差为1.27%～4.29%；进样精密度为1.80%～2.64%。结论：本研究成功建立血栓通注射液中5种皂苷成分LC-MS/MS定量分析方法，方法操作简单，准确度和精密度良好，并完成不同厂家不同批次血栓通注射液中5种皂苷成分测定。

【关键词】LC-MS/MS；血栓通注射液；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；人参皂苷Re；人参皂苷Rd；三七皂苷R1

LC-MS/MS method for rapid quantitative analysis of saponin components in Xueshuantong injection

ZHANG Xiaojun1， FU Huihui2

1.Guangdong Leiyunshang Pharmaceutical Co.， Ltd， Yunfu， Guangdong 527300， China； 2.Yunfu Traditional Chinese Medicine Hospital， Yunfu， Guangdong 527300， China

【Abstract】Objective：To establish a LC-MS/MS method for rapid determination of five saponin components in Xueshuantong injection. Methods：The chromatographic column was BEH C18 （2.1mm * 100mm，1.8 μm），with a flow rate of 0.400 mL/min，the mobile phase was acetonitrile water，the elution method was gradient elution，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 2μL；Adopting the negative ion scanning method under multiple reaction monitoring mode （MRM），and the ion source was ESI-.Results：The linear relationship between ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，ginsenoside Re，ginsenoside Rd，and noto ginsenoside R1 was good within the concentration range，with R2>0.999，and the quantification limits of the five saponin components were from 0.34 to 1.45 ng/mL；The recovery rates of the five saponin components at low，medium，and high concentration levels ranged from 90.59% to 104.10%，and the relative standard deviation was from 1.27% to 4.29%；The precision of injection were between 1.80% and 2.64%.Conclusion：This study successfully established a LC-MS/MS quantitative analysis method for five saponin components in Xueshuantong injection.The method is simple to operate，with good accuracy and precision，and has been used to determine the five saponin components in different batches of Xueshuantong injection from different manufacturers.

【Key Words】LC-MS/MS； Xueshuantong injection； Ginsenoside Rg1； Ginsenoside Rb1； Ginsenoside Re； Ginsenoside Rd； Notoginsenoside R1

血栓通注射液是以三七总皂苷为主要成分的中药注射液[1-2]。目前，血栓通注射剂主要成分采用是HPLC法检测[3]，此方法检测技术简单，但分析时间较长，常规检测分析效率低。LC-MS/MS为药物分析领域的先进检测技术，具有专属性强、灵敏度高、检测时间短等特点[4]。本文成功建立了一种高效率、高灵敏度的血栓通注射液中5种皂苷成分LC-MS/MS测定方法。

1仪器与试药

1.1 仪器与试剂

Waters TQ/S高效液相串联质谱仪（Waters），百万分之一电子天平（上海梅特勒），乙腈为色谱纯（德国Merck公司），水为纯净水（娃哈哈股份有限公司）。

1.2材料

人参皂苷Rg1（批号：110703-201913）、人参皂苷Rb1（批号：110704-202021）、人参皂苷Re（批号：110754-202125）、人参皂苷Rd（批号：110704-202124）、三七皂苷R1（批号：110745-201918），上述对照品均购自中国食品药品检定研究院。6批血栓通注射液收集于当地医院药房，其中S1～3、S4～6分别为厂家A、厂家B。

2 方法

2.1分析方法

2.1.1色谱条件

色谱柱：BEH C18（2.1mm*100mm，1.8μm），流速为0.400mL/min，以乙腈为流动相A，以水溶液为流动相B，洗脱程序见表1；柱温：30℃，进样量：1μL。

2.1.2质谱条件

离子源为电喷雾（ESI），负离子扫描模式，质谱监测采用多重反应（MRM）监测模式，毛细管电压2.50kV，锥孔电压30.00V，离子源温度150℃，去溶剂温度550℃，锥孔气150L/Hr，去溶剂气900L/Hr，碰撞气0.14mL/min，气帘气138kPa，碰撞气48kPa。质谱参数见表2。

2.2对照品溶液制备

分别称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇，制成浓度为100μg/mL单标对照品贮备溶液。分别精密量取各皂苷单标对照品贮备溶液适量，用甲醇稀释制成浓度为5μg/mL混合对照品贮备溶液。

2.3供试品溶液制备

取样品适量，加甲醇溶解，定容，取续滤液即得。

2.4方法学验证

2.4.1线性和定量限

采用逐级稀释法用甲醇制备标示浓度分别为5000、2500、1250、625、250、125及62.5ng/mL混合对照品溶液。每个样品进样1次，记录对应峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算R2值。

采用逐级稀释法用甲醇稀释混合对照品溶液，以信噪比为10皂苷成分浓度为定量限。

2.4.2重复性和准确度

取样品溶液适量，制备1/2平均含量水平溶液，添加混合对照品溶液，制备含量水平达70%、100%及130%水平的供试品溶液，每个浓度平行制备6份，测定1/2平均含量水平溶液2份，以标准曲线法计算各成分含量，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

2.4.3精密度

取625ng/mL混合对照品溶液，连续进样6次，计算进样精密度。

2.5 样品测定

按2.3项下方法制备供试品溶液，在2.1分析方法下依法测定，计算待测成分含量。

3 结果

3.1线性和定量限

LC-MS/MS法测定血栓通注射液中5种皂苷成分的回归方程、相关系数及定量限见表3。可见，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd和三七皂苷R1线性关系良好，R2>0.999，定量限在0.34～1.45ng/mL。

3.2重复性、准确度和精密度

血栓通注射液中5种皂苷成分重复性、准确度和精密度具体参见表4，其中5种皂苷成分低、中、高3种浓度的加样回收率范围为90.59%～104.10%，表明该测定方法准确度良好，且5种皂苷成分3种浓度水平测试的RSD为1.27%～4.29%，表明方法重复性良好。

精密度测定结果表明，5种皂苷成分峰面积的RSD为1.80%～2.64%，说明该方法精密度良好。

3.3样品测定结果

采用建立方法测定市面上的6批血栓通注射液皂苷成分的含量，结果见表5。结果显示，五种皂苷成分的含量测定差异跨度不大，不同厂家不同批次血栓通注射液生产工艺成熟稳定。

4 讨论

本研究分别将五种皂苷成分的单标对照品贮备溶液直接注入质谱，结果发现，5种皂苷成分在负离子模式下离子信息丰富，离子丰度较大，故选用负离子扫描方式。

LC-MS/MS将采用不同分离原理的色谱分离与质谱分离相结合，实现物质的定量分析[5]。本研究中人参皂苷Re、人参皂苷Rd属于同分异构体，质谱裂解碎片完全一致，不能单独依靠质谱的碎片信息实现分离，需采用色谱分离和质谱检测联合方式。色谱分离条件摸索过程中，选用不同色谱柱对5种皂苷成分进行分析，结果发现，Waters BEH C18（2.1mm*100mm，1.8μm）色谱柱通过改变梯度洗脱程序可实现人参皂苷Re、人参皂苷Rd分离基线分离完成定量分析。

综上所述，本文成功建立了LC-MS/MS法同时测定血栓通注射液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd和三七皂苷R1含量测定方法，方法灵敏度高、准确度好，且通过不同厂家不同批次检测分析发现，血栓通注射剂5种皂苷成分含量差异不大，生产工艺相对稳定。

参考文献

[1] 吕晓洲.注射用血塞通和血栓通胶囊序贯治疗脑梗死恢复期瘀血阻滞证的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2021，19（13）： 2258-2261.

[2] 宋艳刚，刘学华，李波.血栓通注射液指纹图谱及多成分定量的快检研究[J].广东药学院学报，2014（6）：722-725

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2020.

[4] 李婷，张珂，李军，等.基于液相色谱-多级多反应监测模式（LC-MRM）的高灵敏定量分析新策略[J].中国药科大学学报，2023，54（6）：718-728.

[5] 牛江涛，曹瑞，司昕蕾，等.LC-MS技术在天然产物黄酮类成分分析中的应用[J].中国现代中药，2020，22（9）：1576-1579.