基于电子鼻技术的樱花花香测定方法的建立

关键词：樱花；电子鼻；花香；正交试验；种质鉴定

中图分类号：S685.99 文献标志码：A 文章编号：1003—8981（2024）03—0281—08

植物花香是园林植物的重要性状之一，也是植物吸引昆虫授粉的重要表现信号，更是评价观赏植物和鲜花的重要质量指标[1-2]。通常，人们对植物香型的研究主要通过顶空固相微萃取、气相色谱- 质谱联用技术和感官评价法。这些方法已经被运用于矮牵牛Petunia hybrida[3]、柚Citrusmaxima（Burm.）Merr[4] 和野茉莉Styrax japonicus[5]等芳香植物的鉴定和分析。但是大多数挥发性物质在花朵中含量极低，不能被人们的嗅觉所感知，因此感官评价法具有主观性极强的缺点。气相色谱- 质谱联用技术对花成分的定性和定量分析精度高，但也存在仪器维护费用高、运行成本高、样品预处理分析时间长等局限性[6]。

电子鼻是一种嗅觉模拟测试工具，通常由一系列非特异性、交叉反应的化学传感器组成，能对气味进行客观的感知、分析和判断。电子鼻技术具有不需要有机溶剂、测量时间短、灵敏度高、易于维护和检测费用低等优点[7]。张正武等[8] 利用电子鼻对陇南34 个花椒Zanthoxylum bungeanum品种进行了区分。潘雁红等[9] 通过研究发现8 种竹笋Bambuseae species 能够通过电子鼻被准确地区分开来。此外，电子鼻技术在花香[10-11]、茶叶[12]、果实品质[13-14]、肉制品[15] 等方面均有应用。

樱花是樱属Cerasus Mill. 植物的总称，属于蔷薇科Rosaceae 李亚科Prunoideae。樱花作为闻名世界的观赏植物，种类丰富、分布广泛、花期集中、观赏价值高。目前国内学者对樱花的研究报道主要集中在育种[16-17]、胁迫[18]、抗氧化能力[19]及其致病性研究[20]，而对于花香的研究暂无报道。

因此，本研究以山樱花Cerasus serrulate 为试材，采用正交设计，分析不同顶空平衡时间、样品量、花期和采样时间对电子鼻测定樱花花香的影响，筛选最佳测定参数。基于最佳参数，开展基于电子鼻技术的不同樱花的种质鉴定分析。以期建立基于电子鼻技术的樱花花香气味快速测定方法应用于樱花种质鉴定，也为其他香源植物的香型分析提供共性技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于江苏省南京市南京林业大学（31°52′11.10″N，118°46′5.53″E），属北亚热带湿润气候，四季分明，雨量充沛，土壤肥沃。年均降水日数为117 d，年均降水量1 106 mm，相对湿度76%，无霜期237 d。

1.2 植物材料

试验材料为3 种具有不同表型性状的樱花，均采自南京林业大学校园内多年生栽培群体。其中东京樱花Cerasus9963260f3673d25c3c8b426d4ba9105e yedoensis 为伞形总状花序，有花3 ～ 4 朵，先叶开放，花瓣数5，花色为粉红色；山樱花为伞房总状花序，有花2 ～ 3 朵，花叶同放，花瓣数5，花色为白色；日本晚樱Cerasusserrulata var.lannesiana 为伞形花序，有花3 ～ 5 朵，花叶同放，花瓣数20 ～ 45，花色为紫红色。于2023 年3 ～ 4 月选择晴天进行采样。选择生长健壮、无机械损害和病虫害、树形大小基本一致的植株。采摘着色均匀的花朵立即放置聚乙烯密封袋内混匀花样后带至实验室内，在室温条件下进行检测。

1.3 试验仪器

PEN3 型便携式电子鼻（德国AIRSENSE 公司），该电子鼻含有10个金属氧化物传感器，不同的传感器对不同的化学成分有不同的响应值。各传感器的类型及性能如表1所示。

1.4 试验方法

1.4.1 电子鼻分析条件

电子鼻检测采用顶空抽样的方法[8]。电子鼻测定参数设置为内部流量180 mL/min， 进样流量180 mL/min，样品间隔1 s，清洗时间60 s，自动调零时间5 s，样品准备时间5 s，测量时间70 s。

1.4.3 基于电子鼻技术的樱花种质鉴定

以东京樱花、山樱花和日本晚樱为研究对象，基于电子鼻检测樱花花香的最佳测定参数，利用电子鼻技术对不同樱花花香的挥发性成分进行鉴定分析。

1.5 数据分析

在使用电子鼻检测樱花样品时，取响应曲线平稳阶段（65 ～ 67 s）的平均值作为样品分析的时间点。使用PEN3 自带的Winmuster 数据处理软件、SPSS26 软件和Origin2021 软件进行方差分析、主成分分析（PCA）、载荷分析（Loadings）及线性判别分析（LDA），利用Excel 软件进行其他分析，采用Origin2021 软件作图。

2 结果与分析

2.1 基于电子鼻技术的樱花花香测定条件筛选

2.1.1 不同处理樱花花香的电子鼻雷达图分析

图1 是基于电子鼻技术对山樱花16 个处理的樱花香气组成成分响应值构建的雷达图。从图1 可以看出，10 个传感器对樱花香气组分的响应存在显著差异（P＜0.01），响应值‘G/G0 值’分布于0.9 ～ 29 之间。W1C、W5S、W1S、W1W、W2W和W3S 传感器对樱花香气组分响应值较大，响应值从高到低依次为W1W、W2W、W5S、W1S、W3S、W1C，其余传感器对樱花香气组分响应值较小（G/G值≈ 1）。因此，优选出W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 传感器进行数据提取与分析。

2.1.2 不同因素对电子鼻响应特性的影响

不同因素对电子鼻各传感器（W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 传感器）的影响见表3。从表3 可知，不同因素对电子鼻测定樱花花香的影响差异显著，对电子鼻传感器的响应影响从大到小依次是不同花期、样品量、采样时间，在不同顶空平衡时间因素下电子鼻各传感器响应值极差均最小。从各因素的不同水平看，在不同顶空平衡时间因素中，水平1、4 高于水平2、3；样品量中水平4 的电子鼻各传感器响应值显著高于其他水平，水平1、2、3 差异不显著；在不同花期因素下，除了W1S 传感器之外，其余传感器在水平3 时的响应值高于其他水平，且与其他水平差异极显著；采样时间中各水平差异不显著。说明电子鼻对盛开时期的樱花花朵且样品量为4 g 时响应较大。

2.1.3 不同处理樱花花香主成分分析

图2 是基于山樱花香气的电子鼻数据（W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 传感器响应值G/G）构建的主成分分析图（PCA）。第一主成分PC1 的贡献率为71.7%，第二主成分PC2 的贡献率为20.8%，总贡献率达到92.5%，说明第一、第二主成分能很好地反映供试样品的整体信息。从图2 可以看出，3、6、8 和14 号处理组合与其他处理组合的样本点没有重叠，由此可以区分出3、6、8 和14 号处理。结合图1 可知8 号处理各传感器的响应值显著高于其他处理，且与其他处理差异极显著。因此，8 号处理，即ABCD 处理组合（在12：00 采集盛开时期的樱花花朵4 g，在顶空平衡30 min 后进行电子鼻测定）的表现最优，为电子鼻快速测定樱花香气的最优组合。

2.2 基于电子鼻技术的樱花种质区分

2.2.1 基于主成分分析和线性判别分析法的樱花种质区分

采用PCA 和LDA 法对3 种樱花进行分析（图3），从图3 可以看出，不同种樱花的样本点没有重叠，每种樱花样本点均有特定的分布区域。PCA结果显示第一主成分PC1 的贡献率为99.33%，第二主成分PC2 的贡献率为0.49%，这两个主要成分解释了总方差的99.82%（图3A），不同种质区分度达到0.677 ～ 0.974。从LDA 分析结果可以看出（图3B），判别式LD1 和判别式LD2 的贡献率分别为75.30% 和23.95%，总贡献率达到99.25%，稍低于PCA 的总贡献率（99.82%），但不同种质区分度为1 高于PCA 分析的区分度，并且从LDA 分析图中发现，每种樱花样本点相比于PCA 样本点更为集中。

2.2.2 载荷分析

为了进一步确认电子鼻传感器对樱花花香挥发性成分响应值的贡献大小，利用载荷分析（Loadings） 分析传感器在当前条件下的相对重要性。从图4 可以看出，第一主成分PC1 的贡献率为82.4%，第二主成分PC2 的贡献率为11.0%，总贡献率为93.4%。传感器W1W、W2W、W5S、W1S、W2S 和W3S 对第一主成分起正向贡献作用，W6S 对第二主成分起主要正向贡献作用。W1C、W3C、W5C 传感器在第一主成分和第二主成分上均起负向贡献作用。W1S 和W3S 主要是对烷烃类的物质有较强的敏感度，W5S、W1W 和W2W 主要是对氮氧化合物及硫化物有主要的贡献力度（表1）。这表明烷烃类、氮氧化合物及硫化物类可能是区分樱花种与品种香型的主要成分。

3 结论与讨论

本研究基于电子鼻技术，以山樱花为试材，采用雷达图对电子鼻传感器响应值进行评价，发现W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 传感器对樱花香气组分响应值较大，其他传感器响应值较小，G/G 值≈ 1，并依此对传感器阵列进行了优化。通过正交试验极差分析和方差分析发现，不同因素对电子鼻测定樱花花香的影响是差异显著的，各因素对电子鼻传感器响应影响大小依次为：花期＞样品量＞采样时间＞顶空平衡时间；从各因素的不同水平来看，顶空平衡时间和样品量在水平4 时显著高于其他水平（顶空平衡时间=60 min；样品量=4 g），在花期中除W1S 传感器外均在水平3 时响应值显著高于其他水平（花期=盛花期），采样时间中各水平差异不显著；根据高响应值确定电子鼻测定樱花花香的最佳组合为A2B4C3D2，即在12：00 采集盛开时期的花朵4 g，在顶空平衡30 min 后进行电子鼻测定。

基于最佳测定参数，利用山樱花、东京樱花和日本晚樱等三种樱花种质进行效果验证。基于电子鼻技术对不同樱花挥发性成分进行检测，大多数传感器对高浓度的挥发性成分的反应值有明显的线性对应关系。通过PCA 分析和LDA 分析发现基于最佳测定参数利用电子鼻技术进行樱花种质区分是可行的，3 种樱花区分均显著，且LDA 的区分度为1 高于PCA 分析的区分度（0.677 ～ 0.974）。LDA 分析的总贡献率为99.25% 稍低于PCA 分析的总贡献率99.82%，但从LDA 分析图中发现，每种樱花样本点相比于PCA 样本点更为集中，并且样本点间并无重叠部分，说明LDA 分析法更适用于樱花种质的区分，与曾辉[21] 使用电子鼻区分不同品种苹果的结果一致。通过Loadings 分析发现，传感器W1W、W2W、W5S、W1S、W2S 和W3S对第一主成分起正向贡献作用，W6S 对第二主成分起主要正向贡献作用，表明烷烃类、氮氧化合物及硫化物类可能是区分樱花种质香型的主要成分。范俊俊[22] 采用电子鼻技术对108 份海棠种质开展海棠香型成分研究，分析发现烷烃类与氮氧化合物及硫化物类可能是区分海棠种与品种两群体的香气的主要作用成分，与本研究结果一致。

随着樱花新品种选育工作的不断深入，樱花新品种的数量不断增加，樱花的表型性状存在丰富变异[23]。传统的根据形态特征来进行樱花种质鉴定难度越来越大。花香被誉为花卉的“灵魂”，是花卉“形、色、香”三要素之一，是评价花卉品质的重要依据，并有可能在花卉植物的抗逆性中起着关键作用[24]。花香挥发性成分主要由烷烃类、烯类、醇类、酮类、醛类、醚类、酯类及芳香族化合物等组成[25]。每一种花香挥发物都具有其独特的气味，它们以不同的结合方式、浓度以及比例使每一种樱花具有独特的香味，因此花香也被认为是种质区分的重要依据[26]。但香气成分鉴定的技术还不够成熟，目前气相色谱- 质谱联用技术在花香测定上比较广泛[27]。气相色谱- 质谱联用技术对花成分的定性和定量分析精度高，但也存在仪器维护费用高、运行成本高、样品预处理分析时间长等局限性，而电子鼻正好克服了这个缺点。电子鼻是一种嗅觉模拟测试工具，可以对气味进行客观地感知、分析和判断。电子鼻技术具有不需要有机溶剂、测量时间短、灵敏度高、易于维护和检测费用低等优点[7]。该技术已经被应用于区分不同的花椒品种[8] 和竹笋品种[9]，鉴定果实品质[14]，鉴别绿茶成分[12] 和花香成分[10] 以及区分具有不同气味强度的海棠类群[22]。这表明，该技术在花香分类和鉴定领域是可行的。

由于试验种质收集数量有限，本研究仅选用了3 种樱花作为研究对象，样本量较少，在后续的研究中将其作为重点改进部分，扩大樱花品种检测数量，构建基于电子鼻技术的樱花花香“指纹图谱”，以期为樱花种质鉴定提供参考，也为其他香源植物的香型分析提供共性技术参考。