采收期对核桃贮藏期间内种皮褐变的影响

关键词：采收期；核桃；内种皮；褐变

中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：1003—8981（2024）03—0255—09

核桃别名胡桃、羌桃，是世界四大干果树种之一[1]。核桃果实的核仁富含脂肪和蛋白质，尤其是含有大量不饱和脂肪酸，营养价值极高[2]，而且亚麻酸、亚油酸等人体必需脂肪酸含量极高，具有降低血液中胆固醇含量、抗动脉硬化以及维持大脑和神经系统功能等药用价值[3]。核仁还含有大量矿物质、维生素、肌醇、褪黑素等物质，具有较好的美容保健功效[4]。

近年来，随着生活水平的提高，营养健康饮食日益受到关注，核桃已成为人们日常膳食中的必备食品[5]，核桃种植面积和坚果产量更是年年攀升，产量的迅速提升对核桃的采后商品化处理和贮藏提出了新的要求。在采后加工贮藏过程中核桃内种皮极易发生褐变，褐变预示着果实开始走向成熟及老化衰退，是影响果实品质及其商品价值的重要因素之一，已成为果实采后商品化处理和贮藏的主要障碍[6-7]。果实采后褐变造成了极大的经济损失，因此，核桃内种皮褐变的控制已成为核桃采后处理和贮藏的关键技术。

采后褐变是果实发生的一种生理代谢失调现象。引起核桃果实褐变的原因众多，如采后失水、机械损伤、遭遇冷害、酶促反应、膜脂氧化、能量匮乏等，而且往往是多种因素共同作用的结果[8]。目前，学界普遍认为多酚氧化酶（PPO）是引起果实酶促褐变的主要酶类，PPO 可以催化酚类等物质氧化，从而引起果实褐变[9]。有研究结果表明，PPO可影响果实褐变速率和发生时间，因此其活性可以反映果实贮藏效果[10]。果实褐变与其成熟度密切相关，过早或过晚采收均会导致果实褐变的加重[11-12]。有研究结果表明，提早采收会影响果实的生长及成熟进程，引起褐变及风味变差，推迟采收因果实成熟度较高、细胞衰老快，同样会加重果实褐变[8]。王志华等[13] 对圆黄梨的研究结果表明，在盛花期后128 ～ 142 d 内，采收越早，果心褐变程度越低；李丽梅等[14] 对‘大久保’桃果的研究结果表明，采收越早，果肉褐变越严重。核桃果实采收过早，不但因为青皮不易剥离而造成污染，而且会影响核仁的饱满度，造成出仁率和粗脂肪含量降低，导致可贮藏时间缩短；采收过晚，会造成大量落果，青皮开裂程度高导致霉菌感染率上升，进而造成果实品质降低[15]。弓弼等[16] 的研究结果表明，适当晚采可以延缓核桃青皮的褐变进程，延长青皮核桃的贮藏期。然而，目前关于采收期对核桃褐变影响的研究报道主要集中在青皮核桃和鲜核桃的保鲜方面，且主要研究采收期对青皮褐变及坚果品质的影响，关于采收期对核桃坚果贮藏期间内种皮褐变影响的研究鲜有报道。本研究中以核桃‘香玲’为试验材料，对3 个采收期的核桃坚果进行加速贮藏（加速褐变），定期测定不同采收期核桃内种皮褐变度及褐变相关生理指标，研究采收期对核桃内种皮褐变度及相关指标的影响，分析贮藏过程中不同采收期核桃的内种皮褐变度与生理指标的相关性，以期为核桃生产中适宜采收期的确定、褐变调控及核桃采后处理和高品质贮藏提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自甘肃省成县大路沟国家核桃良种基地，为‘香玲’嫁接苗。核桃园管理水平一致，树体健壮，无明显病虫害。

1.2 样品采摘及处理

选择树龄相同，长势相似，健康无病虫害的9株核桃树作为采样树。每3 株为1 组，作为1 次重复，共设3 次重复，并对各采样树挂牌标记。参考前人研究基础[16]，结合当地‘香玲’核桃果实发育状况，分别于2023 年的8 月25 日（果实发育120 d左右）、9 月2 日（果实发育128 d 左右）、9 月10 日（果实发育136 d 左右）采摘果实。每次采摘时，各重复按每株树分上、中、下3 层及东、西、南、北4 个方向随机采摘果实60 粒，共180 粒，混合后迅速带回实验室备用。

将所采核桃果实脱青皮，获得坚果，于采收当天每重复各取50 粒坚果作为初始样品（0 d）。剩余的样品置人工气候箱中加速贮藏，贮藏温度25 ℃，相对湿度60%～70%，光照周期为白天16 h、黑夜8 h。每隔15 d 取1 次样，直至贮藏60 d。每次取样后，脱去果壳，取出核仁，用蒸馏水浸泡40 min，剥离内种皮，将内种皮用液氮研成粉末，置-80 ℃冰箱中，备用。

1.3 指标测定

1.3.1 褐变度、相对电导率及丙二醛（MDA）含量参照陈佳妮等[17] 的方法，称取核桃内种皮粉末2 g，加10 mL 95% 乙醇，4000×g 离心20 min，取上清液，在420 nm 波长下测定吸光度（A），以A×10 表示褐变度。参照何小三等[18] 的方法测定相对电导率和丙二醛含量。

1.3.2 总酚含量

总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu 法[19]，略修改。准确称取0.250 g 核仁内种皮粉末样品，置于10 mL 离心管中，加入5 mL 80% 乙醇，60 ℃条件下超声提取30 min，12000 r/min 离心10 min，收集上清液，即为总酚提取液。吸取0.1 mL 总酚提取液，置于10 mL 离心管中，加入2.5 mL 10%福林试剂，摇匀后，室温静置2 min，再加入2 mL7.5% NaCO 溶液充分混匀后，于黑暗环境中反应1 h，在760 nm 波长下测定吸光度。以加入80%乙醇代替提取液作为对照组，以没食子酸绘制标准曲线。总酚含量（X）的计算公式：

X=（C-C）×V×f /m。

式中：C 为样品中多酚质量浓度；C0 为对照中总酚质量浓度；m 为样品质量；V 为提取液的体积；f 为样品稀释倍数。

1.3.3 酶活性

准确称取0.1 g 核仁内种皮粉末样品，加入1 mL 磷酸盐缓冲液，4 ℃条件下以12 000 r/min 离心10 min。收集上清液，即酶活性待测液。

1）多酚氧化酶（PPO）活性。分别吸取0.7 mL磷酸盐缓冲液、0.2 mL 邻苯二酚，置于离心管中，混匀，25 ℃条件下孵育10 min 后，加入0.1 mL 待测液（对照加入0.1 mL 煮沸5 min 处理后的待测液），混匀后于25 ℃条件下反应10 min，然后立即置于沸水浴中5 min。待冷却后，以5 000 r/min离心10 min，测定410 nm 波长下的吸光度。以1 min内1 g 组织在1 mL 体系中使吸光度变化0.01 为1 个酶活力单位。

2）超氧化物歧化酶（SOD）活性。反应体系：0.9 mL 酶提取缓冲液，0.15 mL 甲硫氨酸溶液，0.15 mL NBT，0.15 mL 核黄素，0.15 mL 酶活性待测液。其中对照组加缓冲液代替酶液，做2 个对照管。混匀后，将其中1 个对照管用双层黑色硬纸套遮光，另1 个对照管不进行任何处理并与其他试管同时置于4 000 lx 日光灯下反应10 ～20 min，当未处理的对照管中液体呈蓝色，而遮光的对照管中液体仍为黄色时，结束反应，测定各管中液体在560 nm 波长下的吸光度。将NBT 还原抑制到对照的50% 时所需要的酶量定义为1 个酶活力单位。

3）过氧化物酶活性（POD）活性。在离心管中依次加入0.58 mL 磷酸盐缓冲液、0.2 mL0.5 mol/L H2O2、0.2 mL 25 mmol/L 愈创木酚和0.02 mL 待测液，涡旋混匀，测定470 nm 波长下的吸光度。以每分钟内吸光度变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位。

4）过氧化氢酶活性（CAT）活性。在离心管中依次加入1.6 mL 磷酸盐缓冲液、0.2 mL 待测液和0.2 mL HO，立即在240 nm 波长下测定吸光度，以1 min 内吸光度减少0.1 的酶量为1 个酶活单位。

1.4 数据分析

所有指标数据均重复测定3 次。用SPSS 23.0软件进行多重比较、Pearson 相关性分析和主成分分析，用Origin 2022 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 采收期对核桃内种皮褐变度的影响

由图1 可知：贮藏0 d 时，8 月25 日采收的核桃内种皮的褐变度最小（2.14），且与其他采收期差异显著（P ＜ 0.05），8 月25 日和9 月2 日采收的核桃间差异不显著（P＞0.05）；随着贮藏时间的延长，3 个采收期的核桃内种皮褐变度均表现为上升趋势，在贮藏15 d 前上升幅度较小（平均上升62.26%），贮藏15 ～ 30 d 时褐变度上升幅度最大（244.07%）；贮藏45 d 后，9 月2 日采收的核桃内种皮褐变度上升幅度小于其他2 个采收时期；贮藏结束（60 d）时，不同采收时期的核桃内种皮褐变度差异显著（P＜0.05），其中8 月25 日采收的核桃内种皮褐变度最大（22.35），其次是9 月10 日采收（21.68），9 月2 日采收的褐变度最小（19.78）。

2.2 采收期对核桃内种皮相对电导率的影响

由图2 可知： 贮藏前（ 贮藏0 d）， 不同采收期核桃内种皮的相对电导率均较小（平均为9.17%）；随着贮藏时间的延长，各采收期核桃内种皮的相对电导率均表现为上升趋势，且在贮藏0 ～ 15 d 时上升最快，贮藏15 d 时平均为61.28%；贮藏30 d 后上升有所减慢，且9 月2 日采收的核桃内种皮的相对电导率总体表现为小于其他采收时期；贮藏结束（贮藏60 d）时，9 月10 日采摘的核桃内种皮的相对电导率最高（94.01%），9 月2 日采收的核桃内种皮的相对电导率最小（86.11%）。

2.3 采收期对核桃内种皮MDA 含量的影响

由图3 可知，随着贮藏时间的延长，不同采收期的核桃内种皮的MDA 含量总体呈上升趋势，但不同采收期核桃内种皮MDA 含量的上升速率不同。其中：8 月25 日和9 月10 日采收的核桃内种皮MDA 含量在贮藏0 ～ 30 d 时上升速率较快，贮藏30 d 后开始减慢；9 月2 日采收的核桃内种皮MDA 含量在贮藏0 ～ 15 d 时上升较快，贮藏15 ～ 45 d 时开始减慢，贮藏45 d 后又迅速上升。在贮藏30 d 后，9 月2 日采收的核桃内种皮MDA含量小于其他采收时期，且在贮藏30 ～ 45 d 时与其他采收期样品间的差异显著（P ＜ 0.05）。

2.4 采收期对核桃内种皮总酚含量的影响

如图4 所示，随着贮藏时间的延长，不同采收期的核桃内种皮总酚含量总体表现为下降趋势。贮藏初期（贮藏0 d），9 月10 日采收的核桃内种皮总酚含量最高（175.79 mg/g），其次是9 月2 日采收的核桃（172.41 mg/g），8 月25 日采收的核桃内种皮总酚含量最低（164.64 mg/g）；贮藏0 ～ 15 d 时，各采收期核桃内种皮的总酚含量迅速降低，贮藏15 ～ 30 d 时均迅速升高，贮藏30 d 时9 月2 日采收核桃内种皮的总酚含量最高（162.03 mg/g）， 其次为9月10采收的核桃（158.08 mg/g），8 月25 日采收核桃的内种皮总酚含量最低（153.37 mg/g）。贮藏30d后，各采收期核桃内种皮的总酚含量再次降低，但贮藏结束（60 d）时，各采收期的核桃内种皮仍然保持较高的总酚含量，其中9 月2 日采收的核桃内种皮总酚含量最高（147.79 mg/g），其次是8 月25 日采收的核桃（143.25 mg/g），9 月10 日采收的核桃内种皮总酚含量最低（140.86 mg/g）。

2.5 采收期对核桃内种皮酶活性的影响

2.5.1 对PPO活性的影响

由图5 可知，随着贮藏时间的延长，各采收期核桃内种皮的PPO 活性均呈现先上升、后下降的趋势，且在贮藏15 d 内PPO 活性上升较慢，在贮藏15 ～ 30 d 时快速上升，贮藏30 d 后所有核桃内种皮的PPO 活性开始迅速下降。贮藏初期（贮藏0 d），8 月25 日采收的核桃内种皮PPO 活性为105.97 U/（g·min），9 月2 日采收的核桃内种皮PPO 活性为107.45 U/（g·min），9 月10 日采收的核桃内种皮PPO 活性为109.03 U/（g·min）；贮藏15 d后，不同采收期核桃的PPO 活性开始出现差异，30 d 后，9 月2 日采收的核桃内种皮PPO 活性均小于其他2个采收期的样品；贮藏30 d 时所有采收期的核桃内种皮PPO 活性均达到峰值，其中8 月25 日采收的核桃内种皮PPO 活性最高，达199.46 U/（g·min）；其次为9 月10 日采收的核桃，其内种皮PPO 活性为194.10 U/（g·min）；9月2日采收的核桃内种皮PPO 活性最低，为182.87 U/（g·min）。

2.5.2 对SOD活性的影响

由图6 可知， 贮藏0 ～ 15 d 时， 各采收期核桃内种皮的SOD 活性迅速升高， 且在贮藏15 d 时达到峰值，其中8 月25 日采收核桃内种皮的SOD 活性为532.25 U/（g·min），9 月2 日采收的为539.52 U/（g·min），9 月10 日采收的为531.49 U/（g·min）。贮藏15 ～ 30 d 时，各采收期核桃内种皮的SOD 活性均有所下降，但下降幅度不大；贮藏30 d 后，所有采收期核桃内种皮的SOD 活性又开始缓慢上升，9 月2 日采收核桃内种皮的SOD 活性显著高于其他采收时期的样品（P ＜ 0.05）。

2.5.3 对CAT 活性的影响

由图7 可知，各采收期核桃内种皮的CAT 活性总体呈现上升趋势。贮藏0 ～ 15 d 时CAT 活性上升缓慢； 贮藏15 ～ 30 d 上升较快； 贮藏30 ～ 45 d 时CAT 活性有所下降，但下降幅度不大；贮藏45 d 后又开始迅速上升。贮藏30 d 后，9月2日采收核桃内种皮的CAT 活性始终高于其他采收时期的样品。贮藏结束时，9 月2 日采收的核桃内种皮CAT 活性最高，达246.18 U/（g·min）；其次是9 月10 日采收的核桃，其内种皮CAT 活性为237.44 U/（g·min）；8 月25 日采收的核桃内种皮CAT 活性最低，为228.32 U/（g·min）。

2.5.4 对POD活性的影响

由图8 可知， 贮藏初期（ 贮藏0 d），各处理组核桃内种皮的POD 活性均较高， 其中8 月25 日采收核桃内种皮的POD 活性为411.66 U/（g·min），9月2日采收核桃内种皮的POD 活性为417.01 U/（g·min），9 月10 日采收核桃内种皮的POD 活性为412.39 U/（g·min）。贮藏0 ～45 d 时，各采收期核桃内种皮的POD 活性均迅速下降，且表现为9 月2 日采收的核桃内种皮POD活性始终大于其他采收期核桃；贮藏45 d 后各采收期核桃内种皮的POD 活性有所升高。贮藏结束（贮藏60 d）时，9 月2 日采收核桃内种皮的POD 活性最高，为332.19 U/（g·min）；其次是8 月25 日采收的核桃，内种皮POD 活性为325.25 U/（g·min）；9 月10 日采收核桃内种皮的POD 活性最低，为324.56 U/（g·min）。

2.6 核桃内种皮褐变度及相关生理指标的相关性

‘香玲’核桃贮藏期间内种皮褐变度及7 个生理指标间的相关性分析结果如表1 所示。由表1可见，各指标间存在不同程度的相关性。其中褐变度与MDA 含量、相对电导率、PPO 活性、SOD活性、CAT 活性呈现显著正相关（P ＜ 0.05）；褐变度与POD 活性呈现显著负相关（P ＜ 0.05）；褐变度与总酚含量呈现负相关，但相关性不显著。

以2 个主成分对应的方差贡献率a1、a2 作为权数，结合主成分得分，建立不同采收期核桃内种皮褐变程度的综合评价数学模型：F=aZ+aZ。将不同采收期核桃内种皮褐变相关指标数据标准化后分别代入Z、Z，得到不同采收期核桃内种皮褐变的主成分综合得分（F），结果如图9 所示。由图9 可知：在贮藏前期（贮藏15 d 内），3 个采收期核桃内种皮褐变的主成分综合得分均较小，表明此阶段各采收期核桃内种皮的褐变程度较低；贮藏30 d 后，8 月25 日和9 月10 日采收核桃内种皮褐变的主成分综合得分均高于9 月2 日采收的核桃，表明在贮藏后期，8 月25 日和9 月10 日采收核桃内种皮的褐变程度高于9 月2 日采收的核桃。

3 结论与讨论

本研究结果表明，采收期对贮藏期间核桃内种皮褐变相关生理指标有一定影响。由褐变指标的主成分综合得分可知，贮藏前期，3 种采收期核桃内种皮的褐变程度较小，且差异不明显，但在贮藏30 d 后，所有采收期核桃内种皮的褐变程度均有所加重，其中，9 月2 日采收的核桃内种皮褐变程度显著低于其他2 个采收期的核桃。说明过早或过迟采收，均会加速贮藏期间坚果内种皮的褐变，进而影响核仁品质。因此，在核桃生产中，选择适宜的采收期并及时采收，能延长核桃坚果的贮藏期，提高贮藏过程中核桃坚果的品质。

果实在采后，随着组织的衰老代谢，产生大量活性氧，造成膜脂过氧化，最终产生大量MDA。相对电导率可以衡量细胞膜的完整程度，间接反映膜脂的过氧化程度[20]。因此，MDA 含量和相对电导率可被作为评价植物细胞膜脂过氧化程度的重要指标[21]，同时也是评价植物衰老进程的重要参数[22]。本研究结果表明，在贮藏过程中核桃内种皮的MDA 含量和相对电导率均呈现上升趋势，且两者呈现显著正相关，说明在贮藏过程中不同采收期的核桃内种皮均发生了膜脂过氧化反应，且随着贮藏时间的延长，衰老和过氧化程度增加，其中，在贮藏后期9 月2 日采收核桃内种皮的MDA 含量和相对电导率均显著低于其他采收期的核桃，说明9 月2 日采收的核桃在采后贮藏期间膜脂过氧化程度较轻。

核桃内种皮含有丰富的酚类物质（其含量远高于核仁）[23]。一方面，酚类物质具有较强的抗氧化活性，能够保护核仁免受脂肪酸的氧化作用；另一方面，酚类物质会作为酶促褐变的底物，在PPO 的催化下被氧化，进而引起褐变[24]。本研究结果表明：在贮藏15 d 内，所有采收期核桃内种皮的总酚含量呈现下降趋势，但PPO 活性和褐变度增加幅度不大；在贮藏15 ～ 30 d 时，总酚含量、PPO 活性及褐变度均迅速上升。可能是因为贮藏初期主要发生的是膜脂氧化过程，因此褐变程度较轻，贮藏15 ～ 30 d 时随着膜脂过氧化程度的加深，膜结构被破坏，区室解离，导致PPO 与酚类充分接触，从而导致褐变度增加[25]。在贮藏后期，9 月2 日采收核桃内种皮的总酚含量高于其他2 个采收期的核桃，说明适时采收能使核桃在贮藏期间保持较高的总酚含量，延缓膜脂过氧化程度。

SOD、CAT 及POD 是植物组织膜保护系统十分重要的酶，与组织褐变有密切的联系[8]。SOD作为抗氧化系统的第一道屏障，会首先清除自由基，同时会产生HO的积累，再由CAT、APX 等酶清除HO，从而减少活性氧的积累[26]。本研究中：贮藏前期（贮藏15 d 内），SOD 活性迅速增加，CAT 活性上升较慢，表明在贮藏前期，SOD是清除活性氧的主要酶类；随着贮藏时间的延长，SOD 活性上升变慢，甚至出现下降，可能是由于随着贮藏时间的延长，细胞老化和破坏严重，影响了SOD 相关蛋白的合成[27]。POD 广泛存在于植物组织中，且活性较强，是一种含血红素的氧化还原酶，能够清除细胞过氧化产生的HO，在植物生长发育和抗逆防御中产生重要影响，同时，在HO 存在条件下，POD 可催化酚类物质氧化，造成组织的褐变[28]。本研究中，贮藏0 ～ 45 d 内，不同采收期核桃内种皮的POD 活性呈现下降趋势，贮藏45d后POD 活性有所上升。可能是由于在贮藏前期POD 作为主要氧化酶类，和PPO 一起参与了催化酚类物质的氧化功能；随着贮藏时间的延长，氧化底物总酚含量下降，导致POD 活性降低，随着膜脂过氧化程度的加深，产生了更多的自由基和HO，POD 又参与了HO 的清除，导致其活性升高。也有研究结果表明POD在核桃青皮抗氧化体系的作用不大[8]，还有研究结果表明POD 活性和褐变的关系与植物品种有关[28]，因此，POD与核桃内种皮褐变的关系有待深入研究。

本研究中主要是根据当地果农历年的采收经验，选定8 月25 日、9 月2 日、9 月10 日3 个采收期，对8 月25 日前和9 月10 日后采收的情况未进行研究，后续试验中将增加采收期，深入研究采收期对核桃贮藏期间内种皮褐变的影响。