有机肥替代氮肥对烟草青枯病发生及土壤微生物群落的影响
2024-11-07李宏城高正峰李先伟周国琴宝童曦杨绍磊虞健姚俊杰毛璞麟叶鹏杨智斌肖红药吕芬
摘要：为探究有机肥替代氮肥对烟草青枯病发生及土壤微生物群落的影响，选择有烟草青枯病发病史的田块进行试验，设置常规施肥（CK）、常规施肥70%+牛粪有机肥30%（T1）和常规施肥70%+生物碳基肥30%（T2）3个处理，测定各处理的烟根附近土壤的理化性质和酶活性，采用16S rDNA和ITS基因测序技术探究有机肥替代氮肥对烟草青枯病发生和根际土壤微生物群落结构产生的影响。结果表明，与CK相比，T1、T2处理均提高了土壤pH值、有效磷含量、碱解氮含量以及磷酸酶、脲酶的活性，使青枯病的发病率和病情指数下降；T2处理整体提高了微生物α多样性；PCoA结果表明，有机肥替代氮肥对土壤微生物有显著影响（P<0.05）。在门水平结构分析中，T2处理使酸杆菌门（Acidobacteria）和子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度增加，使变形菌门（Proteobacteria）和毛霉门（Mucoromycota）的相对丰度降低；在属水平结构分析中，使苔藓杆菌属（Bryobacter）和原隐球菌属（Saitozyma）的相对丰度增加，朱氏杆菌属（Chujaibacter）和伞状霉属（Umbelopsis）的相对丰度降低。冗余分析和Pearson分析结果显示，pH值、有效磷含量和碱解氮含量等理化因子是影响土壤中微生物发生变化的关键因子。说明有机肥替代氮肥可改善烟草青枯病的发生情况，对烟根附近的微生物多样性和结构造成的影响较大。本试验中生物碳基肥替代部分氮肥的总体效果最好，适当增加生物碳在基肥中的比例有利于构建良好的土壤环境。
关键词：有机肥；烟草青枯病；微生物多样性；细菌；真菌
中图分类号：S572.06；S154.3 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2024）18-0261-09
收稿日期：2023-09-14
基金项目：贵州省烟草公司重点研发项目（编号：2021XM15）。
作者简介：李宏城（1999—），男，云南大理人，硕士研究生，主要从事烟草微生物研究。E-mail：168383959@qq.com。
通信作者：吕 芬，硕士，副教授，主要从事烟草栽培及生理生化研究。E-mail：lvfen18 @163.com。
烟草是重要的经济作物，长期以来在国家税收中起着不可替代的作用，也能解决部分农村人口的就业问题，增加农民收入。然而，一些烟农长期受到原有思想的禁锢，专业能力不足，甚至不顾及当地烟草公司的相关管理，完全依靠在生产上多年积累的经验栽培而看轻了烤烟的特殊性，为使利益最大化，一味地追求产量；有的年轻烟农只听从长辈的建议栽培而不从发展的角度对待问题，持续施用化肥，造成烟叶产质量与当初的想法相违背，土壤通透性变差，打乱了生物间的内在联系，环保问题变得错综复杂等一系列难以弥补的后果，也加剧了烟草青枯病的严重性［1］。烟草青枯病又叫细菌性萎蔫病，是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）大肆蔓延而引起的，该病发病程度高，寄主分布广泛，频繁发生对烟草产质量造成的影响不可忽视［2-3］。一般情况下，对烟草青枯病的防控措施主要包括从源头上选育抗病品种、针对病情喷洒化学农药及改进栽培方式、加强田间管理等方面［4-6］，但这些防控措施通常导致成本较高、水土资源遭受到污染、所需劳动力较多、投入和回报成正比的关系不够突出。
有研究表明，有机肥替代化肥中15%的氮能够提高土壤速效磷、全氮、全钾、有效硅等一系列营养元素在土壤中所占的比例，还可以增加转化酶、脲酶、脱氢酶的活性［7］。有机肥配施减量化肥对烟草青枯病有一定的防控作用［8］，在很大程度上能使土壤微生物区系朝着有利于植物生长的方向发展，增强其代谢活性，减少土传病害发生，从而提高农产品的产量和品质［9-11］；另有研究表明，与仅仅施加烟草无机专用肥相比，配施一定量有机肥的土壤pH值以及速效磷、有效氯、活性有机质所占的比例，在烟株逐渐长大的还苗期、伸根期、旺长期、成熟期都更高；施用过有机肥的烤烟，在烟叶制作成香烟后，可调和各化学成分间的比例，降低燃烧时对口腔的刺激性，缩减品质低劣的烟气，让消费者抽吸的舒适感、愉悦感上升［12-13］。此外，前人的研究结果表明，土壤微生物的广泛化，可以体现微生物群落层次布局的变化程度、养分吸收水平、彼此间发挥的作用和物种组成数量的变动，尽快展示出地里泥土微环境的系统动态过程［14］，用人为干预的方式，使土壤微生物群落和功能更加多样化，以达到限制庄稼病虫害广泛传播的目的［15-16］。目前，对青枯病缓解的方法是以化学药剂或利用噬菌体减少土壤中的茄科雷尔氏菌为主，在加强对植烟土壤保育的趋势下，用有机肥替代化肥成为研究的焦点，而施用有机肥替代部分化肥减少烟草青枯病发生及对根际微生物群落的影响还需要进一步研究。本试验用不同种类有机肥替代部分化肥，通过测定土壤理化性质及酶活性，研究土壤微生物群落的结构变化，调查青枯病的发病率和病情指数，建立土壤理化性质、酶活性和微生物群落结构与青枯病的内在联系，旨在为当地烟草青枯病的防控和肥料施用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验于2022年4—9月在贵州省安顺市东屯乡（106°14′6″E，26°10′40″N）进行，海拔1 222.7 m。土壤质地为水稻土，试验地平坦，光照充足，灌溉方便，肥力适中且均匀，有较高的烟草青枯病发病史。基础理化性状：pH值5.49，全氮含量3.18%，有机质含量0.94%，有效磷含量126.74 mg/kg，速效钾含量427.18 mg/kg，全磷含量0.78%，全钾含量10.13%，碱解氮含量173.65 mg/kg。
1.2 试验材料
选择云烟87作试验对象。肥料采用的是烟草专用复合肥，N、P2O5、K2O的含量分别为10%、11%、24%；牛粪有机肥，氮、磷、钾养分含量分别为1.79%、1.85%、2.08%；生物碳基肥，氮、磷、钾养分含量分别为3.02%、1.42%、0.64%；普钙（P2O5含量≥12%）、硫酸钾（K2O含量≥52%）。
1.3 试验设计
本试验共设置3个处理，每个处理3次重复，共9个小区，每个小区不低于60株烟苗，株行距为50 cm×110 cm。以当地常规施肥（N含量75 kg/hm2，P2O5含量82.5 kg/hm2，K2O含量180 kg/hm2）为对照（CK），其他2个处理分别为烟草专用复合肥70%+牛粪有机肥30% （T1）处理、烟草专用复合肥70%+生物碳基肥30% （T2）处理。根据牛粪有机肥、生物碳基肥的氮投入比例占总投入养分比例的30%分别计算试验的施肥量，各处理等养分量设计，以等氮量为基准，磷、钾部分不足用普钙、硫酸钾补充。肥料全部以基肥施入，其他各项农艺措施与当地生产优质烟叶的措施一致。
1.4 测定项目及方法
1.4.1 土壤理化性质
参照鲍士旦检测土壤指标的方法［17］，其中测定pH值所用的是电位法；在全氮（TN）含量的检测上采取半微量凯氏法；重铬酸钾容量法-稀释热法用来探究有机质（SOM）含量；在有效磷（AP）含量的测定方面，可采选0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L（1/2H2SO4）法；在速效钾（AK）含量的测定过程中，采取的是NH4OAc浸提-火焰光度计法；选择碱解扩散法测定碱解氮（AN）含量。
1.4.2 土壤酶活性测定
使用具有资质的第三方（苏州格锐思生物有限公司）的试剂盒，对土壤中过氧化氢酶、磷酸酶和脲酶的活性做检测。
1.4.3 病害调查
依据GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》对田间自然发病情况进行病害调查［18］。
发病率=发病的烟株数调查的总烟株数×100%；
病情指数=∑（病级数×该级病株数）最高病级数×调查总株数×100。
1.4.4 土壤微生物测定
土壤细菌：用Illumina Hiseq测序方法判断土壤微生物群落结构和多样性，首先以序列分别是5′-CCTACGGGNGGCWGCAG和GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′的341F和806R作引物，对16S rDNA中V3～V4区域实行扩增，对细菌群落结构和丰富度进行检测，使用TruSeqDNA PCR-free Sample Preparation Kit试剂盒将提制的PCR生成物建立成文库。其次，通过Qubit和Q-PCR的方式检查文库，检查达标过后，使用NovaSeq 6000对DNA文库进行测序工作。测序数据经过Qiime v1.9.1的质量把关，一些质量分数低、长度短的序列将被去除，就能够获得结尾的有效数据。最后，利用Uparse对当前样本的全部有效数据进行聚类，通常默许作为OTU的要求是以97%的相似性序列聚类，紧接着用Qiime v1.9.1中的blast方法与Unit（v7.2）数据库对OTU序列做物种注释，这样不同分类水平的微生物丰度数据将呈现出来［19］。
土壤真菌：选择MN NucleoSpin soil Kit（Machery-nagel，Dueren，德国）的方法，从土壤样品中提取总DNA。以真菌在ITS1保守区为根据，使用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）进行扩增。扩增体系50 μL：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs5 μL，25 mmol/L MgSO4 3 μL，Index Primer（10 μmol/L）1 μL，Universal PCR Primer（10 μmol/L）1 μL，KOD酶1 μL，Template 1 μL（100 ng/μL），ddH2O补足至50 μL。每个样品进行重复扩增、合并，然后使用Cycle Pure Kit（Omega，Norcross，GA，USA）进行纯化，形成测序文库，使用Illumina HiSeq 2500技术进行测序分析。
1.4.5 数据处理
试验数据用Microsoft Excel 和SPSS 26.0进行分析处理，用R语言进行图形绘制。
2 结果与分析
2.1 有机肥替代氮肥对土壤理化性质的影响
由表1可知，不同处理土壤理化性质存在一定差异。相较于CK，T1、T2处理的pH值和有效磷含量均显著升高（P<0.05）；T1处理碱解氮含量显著高于CK，全氮和有机质的含量均高于CK和T2处理，但差异不显著；CK、T1处理的速效钾含量显著低于T2处理。
2.2 有机肥替代氮肥对土壤酶活性的影响
由表2可知，有机肥替代氮肥对土壤的酶活性产生一定影响。T1处理的过氧化氢酶活性低于CK和T2处理，但处理间差异不显著；T1、T2处理的磷酸酶活性显著高于CK，T1、T2处理间差异不显著；T1处理的脲酶活性显著高于CK和T2处理。
2.3 有机肥替代氮肥对烟草青枯病发生的影响
由表3可知，T1和T2处理均降低了发病率和病情指数。与CK相比，T1处理发病率降低1.13百分点，病情指数降低1.46；T2处理发病率降低0.84百分点，病情指数降低1.04。说明有机肥替代氮肥既可降低青枯病的发病率，又能减小青枯病的病情指数。由表4可知，病情指数与土壤中全氮、有机质和速效钾的含量以及过氧化氢酶的活性均呈正相关关系，其中与过氧化氢酶活性的相关性达显著水平；病情指数与土壤pH值、有效磷含量、碱解氮含量、磷酸酶活性、脲酶活性呈负相关关系，其中与碱解氮含量的相关性达显著水平。
2.4 有机肥替代氮肥对土壤微生物群落的影响
2.4.1 有机肥替代氮肥对土壤微生物α多样性的影响
烟草根际土壤细菌和真菌对有机肥替代氮肥有不同的响应。由表5可知，细菌的Sob指数、Chao1指数和ACE指数均表现为T1处理＜CK＜T2处理，Shannon指数表现为CK＜T1处理＜T2处理，处理间差异均不显著。真菌的Sob指数和Chao1指数均表现为CK＜T1处理＜T2处理，ACE指数表现为T1处理＜CK＜T2处理，Shannon指数表现为CK＜T2处理＜T1处理。其中，T2处理Sob指数显著高于CK和T1处理，CK和T1处理差异不显著，其余指数各处理间的差异均不显著。
2.4.2 有机肥替代氮肥对土壤微生物β多样性的影响
对不同有机肥替代氮肥处理的土壤微生物群落进行主坐标分析（PCoA），结果见图1。细菌的PCoA结果（图1-A）能够解释56.75%的变异，真菌的PCoA结果（图1-B）能够解释57.50%的变异，不同处理均处在不同象限，距离间隔也较远，且细菌P=0.005，真菌P=0.002，表明处理间具有显著差异性（P＜0.05），有机肥替代氮肥会对土壤微生物群落的相似性造成影响。
2.4.3 有机肥替代氮肥对土壤微生物群落结构的影响
细菌门水平各群落结构的相对丰度详见图2-A，与T2处理相比，CK和T1处理酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度分别下降了2.78、1.79百分点；相较于T1和T2处理，CK变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度分别提高了1.80、2.51百分点；T1处理放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度相比CK和T2处理分别提高了1.77、2.84百分点；CK绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度相比T1和T2处理分别降低1.95、0.56百分点。真菌门水平各群落结构的相对丰度详见图2-B，T2处理子囊菌门（Ascomycota）相比CK和T1处理分别提高了7.54、12.33百分点，CK毛霉门（Mucoromycota）的相对丰度相比T1和T2处理分别提高了4.20、5.52百分点，T1处理担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度相比CK和T2处理分别提高了0.40、3.48百分点，CK处理被孢霉门（Mortierellomycota）的相对丰度相比T1和T2处理分别提高了2.57、5.35百分点。
细菌属水平各群落结构的相对丰度详见图3-A，可以看出，T2处理苔藓杆菌属（Bryobacter）的相对丰度相较于CK和T1处理分别提高了1.44、1.10百分点；相较于CK，T1和T2处理朱氏杆菌属（Chujaibacter）的相对丰度分别降低了0.22、1.70百
分点，鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）的相对丰度分别降低1.14、0.93百分点。真菌属水平各群落结构的相对丰度见图3-B，相较于CK，T1和T2处理伞状霉属（Umbelopsis）的相对丰度分别降低5.73、1.07百分点；孢球托霉属（Gongronella）的相对丰度分别降低4.04、1.99百分点；T2处理原隐球菌属（Saitozyma）的相对丰度相比于CK和T1处理分别提高1.36、1.27百分点。以上结果表明，有机肥替代氮肥会对土壤微生物门、属水平的群落结构组成造成影响，且不同处理中不同属类的占比不同。
2.4.4 有机肥替代氮肥土壤差异物种分析
利用LEfSe （LDA effect size）分析可以获得有机肥替代氮肥土壤微生物群落的主要差异物种。分析细菌属水平差异物种的结果如图4（LDA＞3.0）所示。CK中Lutispora和居土杆菌属（Humibacter）为特异物种，T1处理中拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）、弯杆菌属（Flexivirga）、土地杆菌属（Pedobacter）和罗河杆菌属（Rhodanobacter）为特异物种，T2处理中ADurbBin063_1和赭黄嗜盐囊菌属（Haliangium）为特异物种。真菌属水平的差异物种分析结果如图5（LDA＞3.2）所示，CK中Boothiomyces为特异物种，T1处理中锥盖伞属（Conocybe）、绿僵菌属（Metarhizium）、Sagenomella和小克银汉霉属（Cunninghamella）为特异物种，T2处理中Conlarium为特异物种。表明与常规施肥相比，有机肥替代氮肥会使土壤属水平微生物群落中特异物种发生改变。
2.4.5 土壤优势微生物群落结构与土壤理化因子之间的冗余分析和关联分析
采用冗余分析（RDA）反映土壤微生物群落结构与土壤理化因子之间的关系。细菌属水平群落的RDA结果如图6-A所示，土壤理化因子中有效磷含量、pH值和碱解氮含量的箭头较长，说明有效磷含量、pH值和碱解氮含量对属水平优势细菌相对丰度的影响较大。在属水平上对土壤细菌群落中相对丰度排前20名的菌属进行Pearson分析，结果如图6-B所示，可以看出，苔藓杆菌属与pH值、有效磷含量呈显著正相关关系；鞘脂单胞菌属与碱解氮呈极显著负相关关系（P<0.01）；Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia与有机质含量、全氮含量呈显著负相关关系，与有效磷含量呈显著正相关关系；弯杆菌属（Flexivirga）与速效钾含量呈显著负相关关系。真菌属水平群落的RDA结果如图6-C所示，土壤理化因子中碱解氮含量的箭头最长，说明对属水平优势真菌相对丰度的影响最大，其次是速效钾含量、pH值、有机质含量。在属水平上对土壤真菌群落中相对丰度排前20名的菌属进行Pearson分析，结果如图6-D所示，被孢霉属（Mortierella）与pH值呈显著负相关关系，与有效磷含量呈极显著负相关关系；金孢子菌属（Chrysosporium）与碱解氮含量呈极显著正相关关系；裂壳菌属（Schizothecium）与有机质、全氮含量呈显著负相关关系。
3 讨论
土壤是烟株生长的养分来源之一，是烟株正常与否的基础，与烟叶的产质量密切相关。对本试验结果而言，与CK相比，T1、T2处理不仅提高了土壤的pH值、有效磷含量和碱解氮含量，还降低了青枯病的发病率和病情指数。其主要原因可能是有机肥中碱性物质的释放，中和了土壤原有的酸性物质导致pH值升高，青枯菌吸收铁元素的效率随着土壤pH值的升高而下降，在对生存和繁衍不利的条件下，随着时间的推移，病菌逐渐减少，导致烟草青枯病的发病率降低［20］。此外，碱解氮含量较高，土壤中有益微生物数量和种类增多，优势增大，对有害菌的排斥力加强，促进烟株长势正常［21］；也有研究表明，土壤pH值、有效磷含量和碱解氮含量升高，能减少病原菌，发病率也随着降低［22］。土壤酶在加快土壤物质循环、提升养分分解效率等方面都产生重要影响，与常规施肥相比，有机肥替代部分氮肥处理的土壤脲酶和磷酸酶活性显著升高，这与杨茜等的研究结果［23］基本一致；T2处理提高了土壤过氧化氢酶的活性，而T1处理的活性降低，这与汪林等的研究结果［24］一致。
微生物与烟株相互作用，相互联系，相互依存，微生物在烟株生长的过程中，扮演了改善土壤肥力和结构的角色，是影响烟株健康的一个重要因素；相反，烟株也能为微生物提供生存所需要的养分、空间。牛粪在发酵堆放后有微生物滋生，施入烟地里可以携带微生物进入土壤，生物碳表面具有很多小孔，独特的构形为微生物生长提供了格外适应的环境，使其持续生存变得容易，充实了土壤细菌α多样性［25］。王亚麒等在贵州的长期定位施肥试验中也发现，有机、无机肥料混合配施，土壤细Mf49eR+siZWLmOvbGuxdJovqFwJBTPlHJPPVkNhMOYs=菌多样性和丰富度可被提高［26］。本试验结果表明，T1和T2处理对土壤微生物群落发挥作用，T1处理会降低细菌的物种数量和丰富度，T2处理提高细菌的物种数量和丰富度，但2个处理都增加了真菌的物种数量和丰富度，特别是T2处理的效果最为明显，这和Luo等的研究结果［27］基本一致。
有机肥被部分氮肥替代后，对土壤微生物群落结构的作用明显。本研究结果表明，与对照组相比，试验组微生物群落的相对丰度均有所改变。在门水平上的细菌群落中，T2处理使酸杆菌门的相对丰度升高，使变形菌门和放线菌门的相对丰度降低；T1处理使放线菌门增加了相对丰度，使变形菌门降低了相对丰度。酸杆菌门的变动有助于平衡土壤内部激素，促进植株生长，提升植物的抗病性和养分利用率，让放线菌门改变相对丰度的原因可能是生物碳改变了土壤的团粒结构，变形菌门固氮以及提高氮肥的利用率是其主要的职能［28-31］；在真菌群落中，T2处理使子囊菌门的相对丰度提高，使毛霉门的相对丰度降低；T1处理使担子菌门的相对丰度提高。子囊菌门能加速土壤有机质分解，具有分解木质纤维素的特殊功能，因此子囊菌门的相对丰度升高，有利于植烟土壤外源有机质的矿化和养分释放［32］。在属水平上，T2处理使细菌群落中苔藓杆菌属的相对丰度提高，降低了朱氏杆菌属的相对丰度；苔藓杆菌属能促进土壤碳循环，在土壤速效磷促进烟草生长发育的过程中起着重要作用［33-34］；T2处理增加了真菌群落中原隐球菌属的相对丰度，T1处理降低了伞状霉属的相对丰度。通过对有机肥替代氮肥土壤进行特异物种分析可知，赭黄嗜盐囊菌属和Conlarium分别是生物碳基肥替代氮肥处理中细菌和真菌的特异物种，其中赭黄嗜盐囊菌属可能是植烟土壤中的益生菌，益生菌的出现让土壤环境向好的方向发展［35］。本试验对土壤微生物群落结构与理化性质进行相关性分析，结果表明，土壤理化因子会对土壤微生物群落结构产生影响，pH值、有效磷含量和碱解氮含量会影响属水平优势细菌的相对丰度，这与王初亮等的研究结果［36］基本一致。在属水平上对土壤微生物相对丰度排前20名的菌属进行Pearson分析表明，苔藓杆菌属与pH值及有效磷含量呈显著正相关关系，鞘脂单胞菌属与碱解氮含量呈极显著负相关关系，被孢霉属与pH值呈显著负相关关系，与有效磷含量呈极显著负相关关系，故推测pH值、有效磷含量和碱解氮含量可能是引起微生物群落变化的主要土壤理化因子，进一步影响烟草青枯病的发生。
4 结论
有机肥替代氮肥能减轻烟草青枯病的发生，且会影响土壤细菌、真菌群落结构和多样性。生物碳基肥替代氮肥提升了酸杆菌门、子囊菌门和苔藓杆菌属的相对丰度，降低了变形菌门、毛霉门和朱氏杆菌属的相对丰度；牛粪有机肥替代氮肥提高了放线菌门和担子菌门的相对丰度，降低了伞状霉属的相对丰度。综上，本试验中生物碳基肥替代氮肥的实际综合效果更好，可作为当地烟区肥料管理和青枯病防控的理论参考。
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