不同冲泡时间和次数对藤茶活性成分的影响

关键词：藤茶；冲泡时间；冲泡次数；活性成分

藤茶，俗称龙须茶、端午茶、神仙草等，是由葡萄科蛇葡萄属多年生藤本植物显齿蛇葡萄［Ampelopsisgrossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang］茎叶经一系列工艺加工而成的代用茶，在民间已有1200年以上的应用历史［1］。藤茶富含黄酮类、多酚类、多糖类、氨基酸、挥发性物质等多种化学成分［2］，其中黄酮类、多酚类物质是其主要活性成分，具有抗菌消炎［3，4］、保肝护肝［5，6］、降血糖血脂［7，8］、抗氧化［9］等功效，是一种典型的药食同源植物资源。

目前，传统茶叶关于冲泡条件对茶汤化学成分和感官品质的影响有较多研究。刘菲等［10］采用正交试验法分析了不同冲泡条件对金骏眉感官品质的影响；辛乐等［11］发现冲泡温度85℃、冲泡时间15min、茶水比1∶30时茯砖茶茶汤浸出物含量较高且感官品质最理想；生书晶等［12］研究表明，红茶、绿茶、铁观音宜在30min内饮用完毕，此时活性物质溶出率较高且亚硝酸盐含量较低；米智等［13］研究了不同冲泡条件对日照绿茶茶多酚得率的影响，发现在冲泡温度80℃、冲泡时间10min、茶水比1∶20时茶多酚得率最高。藤茶品质研究多通过联合多种仪器的分析检测及化学计量学的多元分析来确定藤茶的核心品质指标，Li等［14］利用顶空固相微萃取气质联用技术分析了影响藤茶品质的关键香气物质，万丹等［15］利用超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱联用技术鉴定了藤茶中的18个化合物，张朝阳等［16］利用多元线性回归构建了藤茶品质评价模型，但尚未见冲泡条件对藤茶活性成分和感官品质影响的相关报道。

本研究通过考察不同冲泡时间和次数对藤茶活性成分二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素、多酚、可溶性糖及水溶性浸出物的影响，同时利用主成分分析对数据进行降维，建立活性成分评价模型，以期明确不同冲泡条件下藤茶活性成分变化规律，为指导消费者科学饮用藤茶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

藤茶样品来源于恩施州凤鸣藤茶有限公司（20230910），用于冲泡试验，质量符合DB42/T289-2014的规定。另取藤茶样品适量，粉碎后过425μm孔径筛，用于活性成分本底值的测定。

（2R，3R）-二氢杨梅素对照品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；花旗松素对照品（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；杨梅苷对照品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；杨梅素对照品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；福林酚（1mol/L，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

UltiMate3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；TU-1810PC紫外可见分光光度计（上海普析通用仪器有限责任公司）；SQP分析天平（d=0.0001g，赛多利斯科学仪器有限公司）；SB-5200超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-4恒温水浴锅（金坛科兴仪器厂）；H1850离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UltimateXBC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm，月旭科技股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液的制备 取藤茶样品约3g，精密称定，置于250mL具塞锥形瓶中，沸水150mL冲泡，混匀，分别于冲泡后5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h取样待测。

取藤茶样品约1g，精密称定，置于50mL离心管中，沸水50mL冲泡25min，混匀，5000r/min离心5min，取上清液适量待测，同时精密量取上清液20mL置于恒重的蒸发皿中，测定水溶性浸出物，弃去上清液，残渣按上述操作依次重复4次并取样待测。

1.3.2 黄酮类物质的测定 标准溶液配制：精密称取（2R，3R）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素对照品适量，以甲醇为溶剂配制成浓度分别为81.6μg·mL-1、19.6μg·mL-1、15.6μg·mL-1、10.0μg·mL-1的混合对照品溶液。

样液制备：取藤茶样品（粉碎过筛）约0.5g，精密称定，置于50mL离心管中，精密加入25mL60%甲醇溶液，混匀，称定重量，超声提取30min，取出后冷却至室温，称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，混匀，5000r·min-1离心10min，取上清液适量用于藤茶样品黄酮类物质本底值的测定。

HPLC分析条件：采用UltimateXBC18色谱柱，以甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0-15min，25%A→35%A；15-23min，35%A→50%A；23-25min，50%A→25%A；25-30min，25%A），检测波长（0-21min，290nm，21-30min，255nm），流速1mL·min-1，柱温30℃，进样量10μL，各物质理论塔板数应不低于5000。

定量方法：将“1.3.1”项下供试品溶液及藤茶黄酮类物质本底值测定上清液分别稀释至适宜浓度，采用外标一点法进样分析。由于（2S，3S）-二氢杨梅素对照品不易购得，且相关文献［17］表明，（2R，3R）-二氢杨梅素与（2S，3S）-二氢杨梅素在290nm波长条件下的标准曲线基本一致，因此本研究以（2R，3R）-二氢杨梅素为对照计算（2S，3S）-二氢杨梅素的含量。

1.3.3 多酚含量的测定 藤茶样品多酚本底值及供试品溶液多酚含量按照GB/T8313-2018［18］规定的方法测定，以没食子酸为对照品绘制的标准曲线方程为y=0.0117x-0.0018，R2=0.9993。

1.3.4 可溶性糖含量的测定 藤茶样品可溶性糖本底值及供试品溶液可溶性糖含量参照《植物生理生化实验原理和技术》［19］中的方法测定，以蔗糖为对照品绘制的标准曲线方程为y=0.0068x-0.0142，R2=0.9997。

1.3.5 水溶性浸出物的测定 将“1.3.1”项下置于恒重蒸发皿中的20mL上清液，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，置于干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，计算水溶性浸出物含量。

1.4 数据处理

数据用Excel2010进行初步处理，用SPSS22.0进行标准化处理、主成分分析，用Origin2021绘制相关图形。

2 结果与分析

2.1 黄酮类物质测定结果

不同冲泡时间条件下（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素含量的平均值分别为4.821mg·mL-1、0.704mg·mL-1、43.782μg·mL-1、52.030μg·mL-1、38.296μg·mL-1，方差值分别为0.39、0.01、23.42、18.53、86.63，标准偏差值分别为0.62、0.09、4.84、4.30、9.31，变异系数（标准偏差/平均值*100%）分别为12.88%、13.02%、11.05%、8.27%、24.30%，其中4项指标的变异系数大于10%。

由图1可知，（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素的含量随冲泡时间的增加均呈先升后降的趋势，含量最高时冲泡时间均为30min，最高含量分别为5.287mg·mL-1、0.798mg·mL-1、47.920μg·mL-1，含量最低时冲泡时间均为24h，最低含量分别为3.059mg·mL-1、0.491mg·mL-1、30.508μg·mL-1；杨梅苷含量随冲泡时间的增加呈先上升后逐渐趋于平缓的趋势，冲泡时间6h时，含量最高，为55.977μg·mL-1，冲泡时间5min时，含量最低，为43.657μg·mL-1；杨梅素含量随冲泡时间的增加呈逐渐上升的趋势，冲泡时间24h时，含量最高，为55.363μg·mL-1，冲泡时间5min时，含量最低，为22.492μg·mL-1。

由图2可知，随着冲泡次数的增加，（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素的含量均呈显著下降趋势。冲泡次数为1时，5种黄酮类物质的含量均为最高，分别为5.443mg·mL-1、0.801mg·mL-1、49.670μg·mL-1、53.980μg·mL-1、33.074μg·mL-1，分别占5次冲泡各物质总含量的83.20%、82.41%、81.33%、84.60%、69.22%；冲泡次数为5时，5种黄酮类物质的含量均为最低，分别为0.022mg·mL-1、0.003mg·mL-1、0.188μg·mL-1、0.210μg·mL-1、1.008μg·mL-1，分别占5次冲泡各物质总含量的0.34%、0.34%、0.31%、0.33%、2.11%。

同时，试验测得（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素含量的本底值分别为6.922mg·mL-1、0.193mg·mL-1、60.474μg·mL-1、64.111μg·mL-1、20.383μg·mL-1，结合图1，可知不同冲泡时间（2R，3R）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷的含量均低于各自本底值，（2S，3S）-二氢杨梅素、杨梅素的含量均高于各自本底值。

2.2 多酚含量测定结果

不同冲泡时间条件下多酚含量的平均值为4.415mg·mL-1，方差值为0.13，标准偏差值为0.36，变异系数为8.23%。

由图3可知，多酚含量随冲泡时间的增加呈先升后降的趋势，冲泡时间30min时，含量最高，为4.785mg·mL-1，冲泡时间24h时，含量最低，为3.520mg·mL-1。多酚含量随冲泡次数的增加呈显著下降趋势，冲泡次数为1时，含量最高，为4.913mg·mL-1，占5次冲泡多酚总含量的81.44%，冲泡次数为5时，含量最低，为0.025mg·mL-1，占5次冲泡多酚总含量的0.42%。

同时，试验测得多酚含量本底值为5.468mg·mL-1，结合图3，可知不同冲泡时间多酚含量均低于本底值。

2.3 可溶性糖含量测定结果

不同冲泡时间条件下可溶性糖含量的平均值为31.706μg·mL-1，方差值为4.47，标准偏差值为2.11，变异系数为6.67%。

由图4可知，可溶性糖含量随冲泡时间的增加呈先上升后逐渐趋于平缓的趋势，冲泡时间8h时，含量最高，为33.324μg·mL-1，冲泡时间5min时，含量最低，为27.147μg·mL-1。可溶性糖含量随冲泡次数的增加呈先显著下降后逐渐趋于平缓的趋势，冲泡次数为1时，含量最高，为30.176μg·mL-1，占5次冲泡可溶性糖总含量的94.61%，冲泡次数为5时，含量最低，为0.341μg·mL-1，占5次冲泡可溶性糖总含量的1.07%。

同时，试验测得可溶性糖含量本底值为80.765μg·mL-1，结合图5，可知不同冲泡时间可溶性糖含量均明显低于本底值。

2.4 水溶性浸出物测定结果

5次冲泡试验测得水溶性浸出物含量分别为42.42%、6.37%、1.32%、0.70%、0.40%，分别占5次冲泡水溶性浸出物总含量的82.82%、12.45%、2.59%、1.37%、0.78%。

2.5 不同冲泡时间藤茶活性成分主成分分析

将不同冲泡时间藤茶活性成分数据导入SPSS22.0软件进行KMO和Bartlett检验，KMO值为0.778，大于0.6，Bartlett球形度检验P值为0.000，小于0.05，说明数据适合进行主成分分析。

主成分分析起始特征值分别为5.333、1.543、0.054、0.039、0.020、0.011、0.001，根据特征值大于1的原则，共提取出2个主成分，由表1可知，2个主成分特征值分别为5.333、1.543，方差贡献率分别为76.179%、22.045%，方差累计贡献率98.225%，大于85%，可代表不同冲泡时间藤茶活性成分的大部分信息。

由表1可知，主成分1中各物质载荷系数的绝对值均大于0.7，说明各物质与主成分1之间存在较强的相关性，其中（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、多酚具有较大正载荷量，杨梅苷、杨梅素、可溶性糖具有较大负载荷量。主成分2中（2R，3R）-二氢杨梅素、杨梅苷、多酚、可溶性糖的载荷系数均在0.4-0.7之间，说明其与主成分2之间存在一定的相关性，（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅素的载荷系数均小于0.4，说明其与主成分2之间的相关性较弱，且各物质载荷系数均为正。

利用SPSS22.0软件对不同冲泡时间藤茶活性成分数据进行标准化处理，结合表2主成分的特征向量可得主成分回归方程：

以各主成分对应的方差贡献率为权重，得到不同冲泡时间藤茶活性成分综合评价模型：Y=0.76179Y1+0.22045Y2。由综合评价模型计算出不同冲泡时间藤茶活性成分各主成分得分、综合得分及排名情况，由表3可知，不同冲泡时间藤茶活性成分综合得分由高到低依次为30min、20min、10min、1h、5min、2h、4h、6h、8h、12h、24h。

3 讨论

二氢杨梅素为藤茶中主要活性成分，植物提取来源主要是（2R，3R）-二氢杨梅素［17］，因其具有两个手性中心，易在高温、重结晶、金属离子等条件下发生消旋化，形成（2R，3R）-二氢杨梅素和（2S，3S）-二氢杨梅素的混合物［20，21］。本研究发现，不同冲泡时间（2R，3R）-二氢杨梅素的含量均低于本底值，（2S，3S）-二氢杨梅素的含量均高于本底值，说明（2R，3R）-二氢杨梅素可能在高温条件下发生了部分转化，热稳定性较差，这与樊兰兰等［22］的研究基本相符；随着冲泡时间的增加溶液中逐渐有白色晶体析出，且试验测得（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素的含量随冲泡时间的增加均呈先升后降的趋势，冲泡时间30min时含量最高，这可能与物质本身易溶于热水，室温或冷水中溶解度降低的性质有关。

传统茶叶多按照《茶叶感官审评方法》［23］对六大茶类进行品质评价，而藤茶为药食两用植物资源，除作为冲泡饮品外，还具有一定的药用功效，本研究从活性成分角度分析了不同冲泡时间藤茶7种活性成分变化规律，并利用主成分分析评价筛选出得分最高的冲泡时间，可为藤茶的科学饮用提供理论依据。

冲泡次数可影响茶叶中内含物的浸出、茶汤浸出物的总量及其滋味品质特点［24］。传统茶叶在冲泡品饮时有洗茶的工序，而藤茶中的多种活性成分易溶于热水，本研究表明，冲泡1次时，（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素、多酚、可溶性糖、水溶性浸出物的含量分别占5次冲泡各物质总含量的83.20%、82.41%、81.33%、84.60%、69.22%、81.44%、94.61%、82.82%，冲泡2次时，分别占5次冲泡各物质总含量的95.82%、95.69%、95.48%、96.17%、86.18%、95.93%、96.56%、95.27%，因此藤茶在冲泡品饮时不应洗茶，且冲泡2次时多种活性成分溶出率可达95%以上。

4 结论

本研究明确了藤茶中（2R，3R）-二氢杨梅素、（2S，3S）-二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷、杨梅素、多酚、可溶性糖的含量在冲泡24h内的变化规律，同时利用主成分分析得出冲泡时间30min时综合评分最高；藤茶在冲泡品饮时不应洗茶，多种活性成分在冲泡时间25min、冲泡1次时溶出率可达80%以上，冲泡2次时溶出率可达95%以上。